蔣維++皮玉東++孔玉珊++秦王閣閣++劉士平++薛艷紅

摘要：以三峽河岸帶植物秋華柳（Salix variegata）為研究對象，分離了其在淹水脅迫前后不同部位的內生細菌，在測定其總抗氧化能力的基礎上，對部分具高抗氧化能力的內生細菌進行了生物學鑒定。結果共分離獲得105株內生細菌，其中淹水前共分離54株，淹水后共分離51株。分析表明秋華柳內生細菌的多樣性程度較高，無明顯組織偏愛性，而且其豐富度和多樣性不會顯著受淹水脅迫影響?？寡趸囼灲Y果表明，72 h是測定秋華柳內生細菌總抗氧化能力的最佳時間，淹水脅迫后的內生細菌抗氧化能力強，根部的內生細菌抗氧化能力強。篩選出2株具強抗氧化能力的內生細菌sar3和sar4，其發(fā)酵液的抗氧化值達到40 U/mL， 生物學鑒定結果顯示，這2株菌都是耐寒短桿菌（Brevibacterium frigoritolerans）。

關鍵詞：淹水脅迫；秋華柳（Salix variegata）；內生細菌；抗氧化能力

中圖分類號：Q945.78；Q949.733 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0083-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.021

The Effects of Flooding Stress on Antioxidant Capacity of

Endophytic Bacteria from Salix variegata

JIANG Wei， PI Yu-dong， KONG Yu-shan， QIN Wang-ge-ge， LIU Shi-ping， XUE Yan-hong

（College of Life Science and Pharmacy， Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China）

Abstract： This experiment focused on the Salix variegata plants living in three gorges riparian zone. We isolated the endophytic bacteria from various tissues before and after flooding stress， and performed biological assay based on the total antioxidant capacity analysis. Totally， 105 endophytic bacteria were acquired， involving 54 before flooding and 51 after flooding. These bacteria showed high biodiversity and no obvious tissue preference. Furthermore， bacteria diversity and abundance would be almost unaffected by flooding. According to the antioxidant results， 72 hours maybe the best time to determine the activity. After flooding the total antioxidant capacity of the endophytic bacteria was much higher， and so did the bacteria from roots. sar3 and sar4 were screened for the potent antioxidant capacity， since the maximal value got nearly to 40 U/mL. Biological discern indicated that both be Brevibacterium frigoritolerans.

Key words： flooding stress； Salix variegata； endophytic bacteria； antioxidant capacity

秋華柳（Salix variegata）是一種楊柳科柳屬多年生植物，主要分布在中國云、貴、川、藏及長江中上游的溪流與河谷的岸坡地上，是三峽庫區(qū)消落帶的一種優(yōu)勢灌木[1]。由于其根系非常發(fā)達，可長時間忍受淹水脅迫，故秋華柳對水土保持有重要作用，是一種優(yōu)良的護堤、護岸樹種，也是庫區(qū)消落帶植被恢復與重建的主要物種之一[2]。大部分植物在水淹條件下由于供氧量減少，被迫進行不完全氧化，將會導致OH-、O2-等氧化自由基的積累，從而引起膜脂發(fā)生過氧化，致使生長發(fā)育受阻[3]?？墒乔锶A柳在長江流域每年要承受4～6個月的淹水脅迫，長期的低氧環(huán)境使其進化出極強的抗氧化能力[1，2]。

近年來研究表明，許多高等植物的內生菌可幫助宿主應對各種生物和非生物脅迫環(huán)境，如病蟲害、干旱、高溫、低營養(yǎng)和高鹽脅迫等[4，5]。特別是處于特殊生境下的植物，其體內的內生菌在協(xié)助寄主度過脅迫期中發(fā)揮著重要作用，如從海洋植物紅樹林中分離的內生菌，可提高植物對鹽堿的抵抗能力[6]；從沙漠地區(qū)麻黃中分離的內生菌Chaetomium chiversii，可顯著提高擬南芥對高溫和干旱的耐受能力[7]。此外，內生菌還可提高宿主植物對氧化脅迫的抵抗能力，增強對逆境的適應性[8，9]。Huang等[8]從29種傳統(tǒng)中草藥中分離出了292種不同形態(tài)類型的內生真菌，65%以上的內生真菌表現(xiàn)出很強的抗氧化作用。本實驗室從同是三峽河岸帶植物的疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）中分離到163株內生真菌，大多數(shù)都顯示出較強的抗氧化能力[9]。

為了探討秋華柳的內生細菌是否也具有抗氧化能力，在秋華柳水淹脅迫前后共分離了105株內生細菌，在分析其分布規(guī)律后，利用總抗氧化試劑盒分析了其在胞外的抗氧化能力，并將一些代表性菌株進行了生物學鑒定，研究結果一方面為探究內生細菌協(xié)助秋華柳抗氧化脅迫的機理奠定基礎，另一方面對新型抗氧化劑的篩選與研發(fā)有一定的積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

秋華柳采集自湖北宜昌胭脂壩；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，加水至1 000 mL，調pH至7.2～7.4；次氯酸鈉溶液（天津市天力化學試劑有限公司）；液氮（宜昌藍天氣體有限公司）；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；引物 F8和R1492（生工生物工程（上海）股份有限公司）；dNTP、10×PCR buffer、ExTaq酶、PCR產物回收試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）；T-AOC試劑盒（南京建成生工生物科技有限公司）。

潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、PH-030A型培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、MyCycler PCR儀（美國BIO-RAD公司）、GDS-8000凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）、DYCP-31DN型水平電泳儀（北京市六一儀器廠）、UV752N紫外可見分光光度計（海佑科儀器儀表有限公司）、CH-AS恒溫振蕩器（國華電器有限公司）。

1.2 秋華柳內生細菌的分離

2014年5月和10月，在長江湖北宜昌段的胭脂壩，分別對淹水前（5月）和淹水后（10月）健康秋華柳植株的根、莖、葉取樣，共取15株樣品，每株間隔30 m以上。將樣品用洗潔精和清水洗凈后短時在4 ℃冰箱保存。

取淹水脅迫前后秋華柳植株的葉、根、莖各組織，切成0.5 cm×0.5 cm大小的塊，先用75%乙醇漂洗60 s，然后用無菌水沖洗5次，再用3%的次氯酸鈉漂洗60 s，最后再用無菌水沖洗5次。將最后一次漂洗材料用過的無菌水涂布于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)2 d，觀察有無菌落生長，確保所分離的內生細菌不是來自于樣品表面[10]。

經表面消毒后的組織塊接種于固體LB培養(yǎng)基中，每個平皿接種4個組織塊，5次重復，37 ℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)1～2 d后，挑取植物組織周圍的菌落轉接入LB斜面上，經純化后即得內生細菌。根據(jù)培養(yǎng)基上長出的菌落形態(tài)、大小、顏色等特征挑取不同的單菌落，再利用平板劃線法進行純化，得到的單菌落用甘油于-86 ℃保存。

將純化的菌株接種到培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)1～2 d后，觀察菌落大小、顏色、邊緣、質地、滲出物等指標，并進行革蘭氏染色和顯微形態(tài)觀察。

1.3 菌株發(fā)酵液的總抗氧化性測定

將菌株用LB液體培養(yǎng)基活化，然后將發(fā)酵菌懸液先用紗布過濾，濾液10 000 r/min離心10 min，將所獲得的上清液按照T-AOC總抗氧化試劑盒介紹的方法反應后在520 nm處測定吸光值，3次重復[9]；以空白培養(yǎng)基作對照。

總抗氧化活力計算公式：

T-AOC（U/mL）=■

式中，ODU為測定管吸光度值，ODC為對照管吸光度值，N為反應體系稀釋倍數(shù)（反應液總體積/取樣量），n為樣本測試前稀釋倍數(shù)。

為確定菌株的最佳抗氧化時間，隨機選取秋華柳淹水前后來自根、莖、葉不同部位的4株菌，每24 h測定一次總抗氧化能力。

1.4 內生細菌的生物學鑒定

依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第八版）[11]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]進行生理生化指標的檢測。將形態(tài)學觀察、生理生化指標與16S rDNA測序同時進行。將內生細菌活化培養(yǎng)后，按照細菌基因組DNA試劑盒介紹的方法提取總DNA，然后以總DNA為模板，以F8：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R1492：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為引物擴增其16S rDNA序列[13]。反應體系共20 μL：模板DNA 1.0 μL，正向引物（20 pmol/L） 1.0 μL，反向引物（20 pmol/L）1.0 μL，dNTP mixture 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，10×Buffer 2 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR 擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存[13]。

將擴增獲得的DNA片段用PCR純化試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，重復2次，然后在GenBank中進行Blast比對分析，用MAGE 5.0軟件做系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 秋華柳淹水前后不同部位內生細菌的分布

經過平板劃線法對秋華柳淹水前后不同部位的內生細菌分離、純化后，共獲得105株內生細菌（圖1）。淹水前共分離得到54株，其中19株來自于根，21株來自于莖，14株從葉中分離獲得。在淹水后的秋華柳中共分離得到51株內生細菌，其中根19株，莖15株，葉17株。結果表明秋華柳在淹水前后內生細菌的總量變化不大，說明淹水脅迫對秋華柳內生細菌的數(shù)量影響不明顯。此外，秋華柳根、莖、葉各個器官中都含有內生細菌，分布比較均勻，說明秋華柳的內生細菌對組織的偏愛性不強。

2.2 淹水前后內生細菌的形態(tài)特征

根據(jù)細菌分類指導手冊[11，12]，按照菌落濕度、菌落顏色、革蘭氏染色和顯微形態(tài)等指標（圖2），可將淹水前后秋華柳分離的105株內生細菌劃歸為16類（表1），初步表明秋華柳內生細菌的多樣性程度較高。

從表1可以看出，秋華柳的內生細菌主要集中在菌落表面濕潤呈黃色的這一類中，有44株，占總數(shù)的41.90%；其次是菌落表面干燥呈白色的一類，有22株，占總數(shù)的20.95%。說明這兩類細菌在秋華柳組織內為優(yōu)勢菌株，對其內生環(huán)境有很強的適應性。淹水前的秋華柳分離得到14類內生細菌，淹水后得到12類，說明大多數(shù)種類的內生細菌在淹水前后都存在，而且從整個數(shù)量來說也變化不大，表明淹水脅迫對秋華柳內生細菌的多樣性和豐富性的影響可能不大。

不管是淹水脅迫前還是淹水脅迫后，秋華柳內生細菌中革蘭氏陽性菌都比革蘭氏陰性菌多（圖3）。淹水前革蘭氏陽性菌33株，革蘭氏陰性菌21株；淹水后革蘭氏陽性菌29株，革蘭氏陰性菌22株。革蘭氏陽性菌可能比革蘭氏陰性菌對淹水脅迫敏感一些，因為淹水后革蘭氏陰性菌的數(shù)量幾乎沒有變化，而陽性菌減少了4株，但是淹水脅迫本身不會很大程度上改變革蘭氏陽性菌或陰性菌的分布。

2.3 淹水前后內生細菌的抗氧化能力分析

為了測定內生細菌的總抗氧化能力大小，先隨機挑選了4株菌sbr2、sbr3、sbl3和sas5，根據(jù)不同發(fā)酵時間發(fā)酵液的抗氧化能力來判斷其最佳發(fā)酵時間（圖4）。結果表明，不同內生細菌的最佳抗氧化時間略有不同，但大致的最佳抗氧化時間表現(xiàn)出了一致性。72 h前總抗氧化性值隨時間而增大，72 h后總抗氧化性值隨時間變化而減小，故確定72 h為測定菌株的最佳抗氧化性時間。

將淹水前后秋華柳不同部位共105株內生細菌，培養(yǎng)72 h后測定其發(fā)酵液的抗氧化能力（表2）。從表2可以看出，不同內生細菌的抗氧化能力差異很大，但是都明顯高于對照（2.34 U/mL）。最高值來自淹水脅迫后根部篩選的1株菌，達到41.90 U/mL，遠比文獻[10]報道的要高，說明秋華柳中的內生細菌具有極強的抗氧化活力。

淹水前細菌的平均抗氧化性值為5.66 U/mL，淹水后細菌的平均抗氧化性值為6.34 U/mL（圖5）。而且不管是根、莖還是葉，淹水后秋華柳內生細菌的抗氧化能力明顯高于淹水前，說明淹水脅迫將會影響秋華柳內生細菌的抗氧化活性，誘導高抗氧化活性內生細菌的出現(xiàn)。這一結果也表明秋華柳可能通過高抗氧化活性內生細菌來應對長時間的淹水脅迫。

高抗氧化活性的細菌具有明顯的組織偏愛性。不管是在淹水前還是在淹水后，高抗氧化活性的內生細菌都主要出現(xiàn)在秋華柳的根部，莖部內生細菌的抗氧化能力次之，葉部最小，說明根部內生細菌對秋華柳抗氧化活性的影響最大。

2.4 部分典型內生細菌的生物學鑒定

將2株高抗氧化活性的內生細菌進行生物學鑒定。形態(tài)觀察表明，sar3和sar4均可在LB固體培養(yǎng)基上迅速生長，sar3菌落呈淡黃色，菌落大小適中，邊緣整齊，表面細濕光滑，細菌桿狀，革蘭氏染色為陽性。sar4也呈淡黃色，邊緣呈暗紅色，菌落大而呈圓形，邊緣呈鋸齒狀，表面干燥且不光滑，細菌桿狀，革蘭氏染色亦為陽性。其生理生化指標見表3。

3 小結

試驗從三峽河岸帶植物秋華柳的根、莖和葉中共分離出105株內生細菌，其中淹水前共分離得到54株，淹水后共分離得到51株。根據(jù)形態(tài)觀察，內生細菌的多樣性程度較高，共可分為16類，且對組織的偏愛性不強。秋華柳內生細菌的數(shù)量和類型對淹水脅迫并不敏感，說明淹水脅迫不會顯著影響秋華柳內生細菌的豐富度和多樣性。

72 h是測定秋華柳內生細菌總抗氧化能力的最佳時間。淹水脅迫后的內生細菌比淹水前具有更強的抗氧化能力，根部的內生細菌較其他部位具有更強的抗氧化能力。

結合形態(tài)觀察、生理生化指標分析和16S rDNA測序分析，對2株抗氧化能力最強的內生細菌進行了生物學鑒定，結果顯示它們都是耐寒短桿菌，是一類潛在的抗氧化劑資源。

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