袁遠(yuǎn)　高熹　喜超　楊志新　雷騰云　張連根　朱家位

摘要：利用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技術(shù)，克隆獲得了1條椰子織蛾（Opisina aremosella）的全長(zhǎng)化感蛋白基因序列。該基因全長(zhǎng)為561 bp，開放閱讀框全長(zhǎng)為393 bp，3′和5′端非編碼序列分別為48、120 bp，編碼130個(gè)氨基酸，所編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為14.8 ku，等電點(diǎn)為5.85。同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，椰子織蛾化感蛋白基因氨基酸序列有4個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)且與其他昆蟲化感蛋白基因在氨基酸的水平上相似性不高。除與棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）相似度達(dá)71%外，與其他昆蟲相比，均低于10%。SignalP預(yù)測(cè)顯示，椰子織蛾化感蛋白基因所編碼的前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，椰子織蛾化感蛋白與稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和家蠶（Bombyx mori）化感蛋白1、2、3、4聚為同一族，與家蠶化感蛋白1、2、3、4的進(jìn)化程度最近。這為深入研究昆蟲化學(xué)感受蛋白、揭開昆蟲與環(huán)境化學(xué)信息聯(lián)系的規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：椰子織蛾;化感蛋白;基因克隆;序列分析;系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)： S433.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0043-03

高度發(fā)達(dá)的化學(xué)感受系統(tǒng)對(duì)昆蟲與環(huán)境中的化學(xué)信息聯(lián)系具有重要作用。昆蟲在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，發(fā)展演變出復(fù)雜的化學(xué)信息感受機(jī)制。例如，在覓食、尋偶、產(chǎn)卵等行為中，通過(guò)敏銳的嗅覺、味覺、觸覺等功能，感受各種環(huán)境化學(xué)因子的刺激，從而進(jìn)行精巧的化學(xué)通信，以適應(yīng)環(huán)境選擇，保持種群繁衍[1]。昆蟲發(fā)達(dá)的化學(xué)感受系統(tǒng)功能的發(fā)揮是基于昆蟲各種感器淋巴液中分布著大量的化學(xué)感受蛋白（chemosensory proteins，簡(jiǎn)稱CSPs）和氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding proteins，簡(jiǎn)稱OBPs）。環(huán)境中的氣味分子與各種嗅覺相關(guān)蛋白結(jié)合后，被運(yùn)送至嗅覺神經(jīng)末梢，從而引發(fā)以嗅覺功能為主的各種化學(xué)感受反應(yīng)[2-3]。自1994年McKenna等首次在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）觸角中發(fā)現(xiàn)2種與傳統(tǒng)的氣味結(jié)合蛋白無(wú)論在結(jié)構(gòu)還是在功能上都有明顯差別的蛋白后，研究者們隨后相繼又在多個(gè)目的昆蟲如雙翅目、直翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目、鞘翅目、脈翅目等中鑒定了大量編碼CSP的基因[4-6]。由于此類蛋白主要存在于昆蟲各種化學(xué)感受器，與感受環(huán)境化學(xué)刺激有關(guān)，所以又稱之為昆蟲化學(xué)感受蛋白（chemosensory protein，簡(jiǎn)稱CSP）。CSP種類具有多樣性，表達(dá)部位也不僅僅局限于感受器官，昆蟲CSP在身體各部分的表達(dá)分布具有全面性，種類具有多樣性，種間種內(nèi)分布具有普遍性，而且在雌雄蟲中均有表達(dá)，這些特點(diǎn)易于適應(yīng)接受復(fù)雜的環(huán)境化學(xué)刺激信息，承擔(dān)復(fù)雜的化學(xué)感受功能[7]。CSP在昆蟲行為中扮演著重要角色，故對(duì)其進(jìn)行深入研究，這不僅能闡明昆蟲化學(xué)感受蛋白的作用機(jī)制，更有助于深入解析昆蟲與環(huán)境信息交流本質(zhì)，為進(jìn)一步開拓害蟲防治和益蟲利用新途徑提供了重要基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)昆蟲化學(xué)感受蛋白的研究主要集中于一些較常見的農(nóng)業(yè)害蟲，如煙粉虱、棉花粉蚧、西花薊馬等。對(duì)于椰子織蛾化感蛋白基因的研究相對(duì)來(lái)說(shuō)就很少了，但其危害性卻不容忽視。2013年8月，我國(guó)首次在海南省萬(wàn)寧市興隆鎮(zhèn)華僑農(nóng)場(chǎng)的椰林中發(fā)現(xiàn)椰子織蛾（Opisina aremosella Walker），風(fēng)險(xiǎn)分析表明，該蟲在我國(guó)屬于高度危險(xiǎn)性有害生物，風(fēng)險(xiǎn)值（R值）達(dá)2.20[8]。鑒于椰子織蛾危害的嚴(yán)重性，于2014年被國(guó)家林業(yè)局列為林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物[9]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)椰子織蛾的基因研究較少，僅有關(guān)于形態(tài)特征、生物生態(tài)學(xué)及生物防治方面的介紹性報(bào)道[10-11]。因此，本研究對(duì)椰子織蛾的化感蛋白進(jìn)行克隆和序列分析，旨在探索椰子織蛾感知外界環(huán)境化學(xué)信號(hào)的作用機(jī)制，為今后對(duì)該蟲防治提供新思路和新途徑、研究昆蟲與環(huán)境之間信息聯(lián)系的本質(zhì)規(guī)律奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

椰子織蛾于2016年采自海南椰子樹，于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室以香蕉葉片為寄主培養(yǎng)，待羽化至成蟲收集作為試驗(yàn)材料。

1.2 總RNA的抽提

總RNA的抽提采用TRIZOL試劑盒（Invitrogen）提取。

1.3 RACE

以新鮮抽提的椰子織蛾總RNA為材料，利用Clontech公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，合成3′和5′ RACE cDNA模板，以合成的cDNA為模板，參照RACE試劑盒說(shuō)明書克隆該基因的5′端和3′端序列。PCR采用Advantage 2 PCR kit（Clontech）。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2.5 min，循環(huán)40次;72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收后并純化。用TA克隆法連接pGEM-T-easy載體（Promega），轉(zhuǎn)化宿主菌為DH5α。在X-Gal和IPTG的存在下，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑陽(yáng)性克隆于金思特科技（南京）有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

核苷酸序列的翻譯和氨基酸序列的比對(duì)分析分別使用GENETYX-MIN 5.1和ClustalX 1.83軟件[12]，蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)使用SignalP在線分析工具[13]，結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用M Motifscan[14]，分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用MEGA 4.0進(jìn)行[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA克隆及序列分析

將3′和5′ RACE擴(kuò)增所得目的基因片段進(jìn)行拼接，共得椰子織蛾化感蛋白基因的全長(zhǎng)序列為561 bp，開放閱讀框全長(zhǎng)為393 bp，命名為OarCSP（圖1）。3′和5′端非編碼序列分別為48、120 bp，該基因編碼130個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為14.80 ku和5.85。SignalP預(yù)測(cè)顯示，該蛋白的前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG）。結(jié)構(gòu)分析表明，OarCSP氨基酸序列中潛在1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（TGCE72-75）、2個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)（GQKYTD20-25和GCEKCT73-78）、2個(gè)蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點(diǎn)（TDK24-26和TPR121-123）和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（TGK110-112）。

2.2 同源性比較和進(jìn)化分析

應(yīng)用ClustalX對(duì)OarCSP與其他昆蟲化感蛋白的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)。由圖2可知，OarCSP氨基酸序列具有4個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)，與鱗翅目其他昆蟲相似性不高，其中與棉紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella）、桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）、茶尺蠖（Ectropis obliqua）、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和菜粉蝶（Pieris rapae）的相似性分別為71%、5%、9%、6%、8%。應(yīng)用MEGA 4.0鄰接法（neighbor-joining，簡(jiǎn)稱NJ）對(duì)OarCSP與鱗翅目其他昆蟲CSP氨基酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析，構(gòu)建NJ進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，鱗翅目夜蛾科、蠶蛾科、螟蛾科的化感蛋白聚為2個(gè)族，OarCSP與化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4同源性高，聚為一族。

該分析所用20個(gè)鱗翅目昆蟲化感蛋白的GenBank登錄號(hào)如下：HassCSP[煙青蟲（Helicoverpa assulta）]，ABB91378.1;OfurCSP[亞洲玉米螟（O. furnacalis）]，BAV56805.1;CmedCSP1[稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）]，AIX97823.1;CmedCSP2，ALT31606.1;MbraCSP[甘藍(lán)夜蛾（Mamestra brassicae）]，AAF71289.1;MsepCSP[黏蟲（Mythimna separata）]，JAV45867.1;AipsCSP1[小地老虎（Agrotis ipsilon）]，AGR39577.1;AipsCSP2，AAP57460.1;AdisCSP（Athetis dissimilis），ALJ93810.1;SexiCSP[甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）]，AKT26484.1;HarmCSP1[棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）]，AAK53762.1;HarmCSP2，AFR92097.1;CaurCSP[臺(tái)灣稻螟（Chilo auricilius）]，AIU68827.1;HzeaCSP[美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）]，AAN63675.1;BmorCSP1[家蠶（Bombyx mori）]，NP_001037052.1;BmorCSP2，AAV34688.1;BmorCSP3，AFF18000.1;BmorCSP4，AFD97753.1;SlitCSP[斜紋夜蛾（Spodoptera litura）]，ALJ30219.1。

3 結(jié)論與討論

在研究昆蟲對(duì)環(huán)境化學(xué)因子刺激感受機(jī)制的過(guò)程中，起初的研究重點(diǎn)是對(duì)氣味的感受機(jī)制，昆蟲化學(xué)感受蛋白的研究源于對(duì)昆蟲氣味結(jié)合蛋白的研究。然而，人們發(fā)現(xiàn)昆蟲對(duì)環(huán)境化學(xué)因子刺激的許多行為反應(yīng)并不能用氣味結(jié)合蛋白和氣味感受機(jī)理來(lái)解釋，直到20世紀(jì)90年代CSP的發(fā)現(xiàn)，才為昆蟲對(duì)環(huán)境化學(xué)因子刺激感受機(jī)理開辟了新的途徑。本研究利用RACE技術(shù)，從椰子織蛾中克隆獲得1個(gè)CSP基因，根據(jù)其cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列表明，OarCSP具有昆蟲化感蛋白的典型特征：相對(duì)分子量小，為14.80 ku，N-端存在20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽，具有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)和典型的化感蛋白結(jié)構(gòu)域，這體現(xiàn)了不同昆蟲化感蛋白在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。通常，每一種昆蟲中都存在多個(gè)化感蛋白基因，特別是近年來(lái)隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，許多化感蛋白已迅速地從昆蟲基因組中被發(fā)掘，如從黑腹果蠅、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、意大利蜜蜂和家蠶的基因組中分別獲得4、8、6、22個(gè)化感蛋白基因，且有假基因的存在。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，CSP編碼基因數(shù)目在各昆蟲物種中都少于化學(xué)感受受體（OR或GR）和OBP編碼基因數(shù)，還有很多化感蛋白沒有被發(fā)現(xiàn)[16]，據(jù)此可知，更多的椰子織蛾化感蛋白基因有待克隆獲得。多序列同源性分析表明，OarCSP與同目的昆蟲相似性均較低，這主要是因?yàn)槠窕械鞍變H在家蠶、小地老虎、棉鈴蟲、煙青蟲等少數(shù)鱗翅目昆蟲中報(bào)道，尤其是在織蛾科鮮有報(bào)道的緣故。此外，這體現(xiàn)了不同昆蟲物種在生物演變過(guò)程中化感蛋白的進(jìn)化現(xiàn)象，也反映了不同昆蟲之間化感行為的多樣性，這可能是不同昆蟲在適應(yīng)不同環(huán)境中接受復(fù)雜化學(xué)信息刺激的進(jìn)化結(jié)果。經(jīng)分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，OarCSP與化感蛋白OfurCSP、CmedCSP1、BmorCSP1、BmorCSP2、BmorCSP3、BmorCSP4聚為同一族，表明它們應(yīng)為同一家族，尤其是OarCSP與家蠶化感蛋白BmorCSP1、2、3和4的進(jìn)化程度最近，它們之間的組織表達(dá)分布、生理功能等應(yīng)相似。

昆蟲與環(huán)境之間的化學(xué)通信對(duì)于昆蟲生存和繁殖至關(guān)重要，昆蟲CSP遍布幾乎所有感受器，起到感受、溶解、運(yùn)輸、傳導(dǎo)環(huán)境化學(xué)刺激因子的作用[17]。其對(duì)昆蟲感知外界化學(xué)環(huán)境的變化具有關(guān)鍵作用。通過(guò)研究CSP開發(fā)害蟲產(chǎn)卵忌避劑等“昆蟲行為防治劑”，以及益蟲利用新技術(shù)等一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和目標(biāo)。通過(guò)掌握昆蟲對(duì)環(huán)境化學(xué)刺激的分子感受機(jī)制，闡明昆蟲行為反應(yīng)的本質(zhì)，有利于提高益蟲利用和害蟲治理效率。但要明確昆蟲化學(xué)感受蛋白的化學(xué)信息轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，還要對(duì)昆蟲化感蛋白進(jìn)行深入研究，才能為防治害蟲和利用益蟲提供新思路和新途徑。本研究克隆獲得椰子織蛾氣化感蛋白OarCSP的基因全長(zhǎng)序列，為深入研究昆蟲化學(xué)感受蛋白，揭開昆蟲與環(huán)境化學(xué)信息聯(lián)系的規(guī)律奠定理論基礎(chǔ)。

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