孫會(huì)娟,趙 濤

( 1.陜西渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院 陜西 渭南 714000； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系輻射防護(hù)醫(yī)學(xué)教研室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評(píng)估與防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 西安 710032)

現(xiàn)今，電離輻射在醫(yī)藥衛(wèi)生、國(guó)防安全、工業(yè)加工等眾多領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，而人類在享受電離輻射帶來益處的同時(shí)也承受著它對(duì)健康造成的威脅[1]。目前為止，現(xiàn)有輻射防護(hù)劑仍未能攻克毒副作用大、價(jià)格昂貴等難題，因而無法廣泛推廣應(yīng)用。中藥五倍子的主要有效成分五倍子酸(gallic acid，GA)，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、抗突變等生物活性作用[2]。研究表明，GA能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而對(duì)正常細(xì)胞無殺傷作用，此特點(diǎn)決定了其作為輻射防護(hù)劑研究的可行性[3]。本研究通過觀察GA對(duì)60Co-γ射線輻照人腸上皮細(xì)胞(HIEC)的防護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制，旨在探尋更加安全、經(jīng)濟(jì)、高效的新型輻射防護(hù)藥物，以豐富輻射防護(hù)藥物家族。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

GA(純度98 %，空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供)； RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(山東四季青生物技術(shù)公司)；胰島素(遼寧天醫(yī)生物制藥股份有限公司)；磷酸緩沖鹽(PBS)(美國(guó)Solarbio Amresco 公司)；姬姆薩(Giemsa)染液(本實(shí)驗(yàn)室自制)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)(南京建成生物公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(武漢Thermo公司)；RIPA 裂解液(南京碧云天生物公司)；Cyclin D1蛋白、CDK4蛋白(武漢Amresco公司)；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin) ( CST公司)。

1.2 主要儀器

60Co-γ射線(空軍軍醫(yī)大學(xué)鈷源輻照中心)；低溫離心機(jī)(Heraeus公司)；二氧化碳孵育箱(日本池本理化工業(yè)株式會(huì)社)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-RAD Model680)；熒光顯微鏡(日本Nikon 公司)；Power PacTMHC 高電流電泳儀、Mini-PROTEAN?電泳槽、Mini Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-RAD)。

2 方法

2.1 GA配制

精確稱取GA 34.024 mg，溶于10 ml反滲透水，混勻，用0.22 μm濾器過濾，制成20 mmol/L母液，置4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前用 RPMI 完全培養(yǎng)液，稀釋成不同濃度的GA溶液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HIEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %FBS、1 %雙抗的RPMI培養(yǎng)基(0.25 U/ml胰島素)，置37 ℃、5 %的CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將HIEC細(xì)胞分為3組，分組如下。①空白對(duì)照組：細(xì)胞不接受輻照和未經(jīng)藥物處理；②單純輻照組：細(xì)胞接受4Gy60Co-γ射線照射；③GA+輻照組：不同濃度GA作用細(xì)胞6 h 后再接受4Gy60Co-γ射線照射。

2.3 GA對(duì)HIEC細(xì)胞增殖力的影響

取指數(shù)生長(zhǎng)期的HIEC細(xì)胞，接種于3個(gè)96孔培養(yǎng)板上，0.8×104/孔，至細(xì)胞貼壁后設(shè)空白對(duì)照組、GA不同濃度處理組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。GA濃度為0.1、1、10、20、40、60、80、100、200 μmol/L,分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定吸光度(OD)，測(cè)定細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD平均值-空白對(duì)照組細(xì)胞OD平均值)/空白對(duì)照組細(xì)胞OD平均值[4]

上式中實(shí)驗(yàn)組為各GA濃度組。

2.4 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞克隆形成力的影響

取指數(shù)生長(zhǎng)期的HIEC細(xì)胞，以4×102/孔接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后設(shè)置空白對(duì)照組、輻照組和GA+輻照組。GA+輻照組細(xì)胞在照前分別給予終濃度為1、10、20 μmol/L的GA共培養(yǎng)，6 h后接受4 Gy的60Co-γ射線照射，照后1 h內(nèi)棄掉舊培養(yǎng)液，加新鮮培養(yǎng)液3 ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至照后11 d或顯微鏡下可見50個(gè)以上細(xì)胞組成的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS沖洗，甲醇固定20 min，0.8 % Giemsa染色3 h，清洗晾干后顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)[3,5]。

克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100 %；

克隆增殖率=[(處理組細(xì)胞克隆形成率﹣空白對(duì)照組克隆形成率)/空白對(duì)照組克隆形成率]×100 %[5]

上式中處理組為各GA濃度組。本實(shí)驗(yàn)輻射條件選取4 Gy的60Co-γ射線照射，劑量率為99 cGy /min，該暴露參數(shù)是依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果而定[3,5]。

2.5 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞增殖力的影響

取指數(shù)生長(zhǎng)期HIEC細(xì)胞，種植于96孔培養(yǎng)板上，0.3×104/孔，貼壁后按實(shí)驗(yàn)“2.4”項(xiàng)方法分組并進(jìn)行GA預(yù)處理。細(xì)胞經(jīng)4 Gy60Co-γ射線照射后1 h內(nèi)棄掉舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液2 ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)算細(xì)胞增殖率計(jì)算方法同實(shí)驗(yàn)“2.3”項(xiàng)。

2.6 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞脂質(zhì)過氧化能力的影響

接種指數(shù)生長(zhǎng)期的HIEC細(xì)胞于10 cm培養(yǎng)皿上(1.5×105/ ml，4 ml/孔)， 待細(xì)胞貼壁后按上述分組及處理。4 Gy60Co-γ射線照射后1 h內(nèi)棄掉舊液，加入新鮮培養(yǎng)液4 ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，冰上裂解15 min，4℃離心(12 000 g×15 min)，根據(jù)試劑盒說明，檢測(cè)脂質(zhì)過氧化指標(biāo)SOD、MDA和GSH的活力[6]。

2.7 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

HIEC細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，按上述分組及處理后，用Western-Blot法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK4的表達(dá)。具體操作方法：用100～200 μl的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解20 min，4 ℃離心(12 000 g×15 min)，取上清液用BCA 蛋白試劑盒進(jìn)行Cyclin D1和CDK4蛋白定量。用10% SDS/PAGE凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，電泳后用PVDF膜轉(zhuǎn)印，封閉1 h，再與TBST稀釋的一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗分別孵育1～2 h。后用高敏化學(xué)發(fā)光液孵育，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀掃描條帶。樣本中蛋白表達(dá)量用Quantity One-4.6.2 (Bio-Rad,Hercule,CA)軟件進(jìn)行半定量分析處理[7]。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

3 結(jié)果

3.1 GA對(duì)HIEC細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

圖1表明：隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GA對(duì)HIEC細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用，但在12 h內(nèi)GA(0.1、1、10、20、40)μmol/L與對(duì)照組相比，對(duì)HIEC細(xì)胞增殖作用顯著，且0.1、1、10 μmol/L的GA作用更為顯著(P<0.05)，本結(jié)果為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的給藥時(shí)間和藥物濃度范圍。

圖1 不同濃度GA對(duì)HIEC細(xì)胞活力的影響 *P<0.05，與空白對(duì)照組比較

3.2 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞克隆形成力的影響

如圖2所示，細(xì)胞經(jīng)4 Gy60Co-γ射線照射后，各輻照組克隆形成能力均顯著下降(P<0.05)。而照前6 h給予GA預(yù)處理能顯著改善HIEC細(xì)胞的克隆形成力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1、10、20 μmol/L的GA預(yù)處理可使HIEC細(xì)胞的克隆形成力分別由7.2 %上升到22.7 %、22.1 %和15.7 %，其中1 μmol/L的GA預(yù)處理組效果優(yōu)于(10、20)μmol/L的GA預(yù)處理組。實(shí)驗(yàn)表明，GA能減輕輻照所致HIEC細(xì)胞克隆形成能力下降的程度。

圖2 不同濃度GA對(duì)輻射損傷HIEC細(xì)胞克隆形成能力的影響 *P<0.05，與對(duì)照組比較

3.3 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞增殖力的影響

結(jié)果如圖3，本實(shí)驗(yàn)條件下，輻照組HIEC細(xì)胞活力顯著下降，而照前6 h給予一定程度GA預(yù)處理能顯著提高HIEC細(xì)胞的增殖能力，其中以(1、20) μmol/L 的GA預(yù)處理組作用效果最顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，GA可以提高受照HIEC細(xì)胞的增殖能力。

圖3 不同濃度GA對(duì)輻射損傷HIEC細(xì)胞活力的影響 *P<0.05，與輻照組比較

3.4 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞脂質(zhì)過氧化能力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與空白對(duì)照組相比4 Gy的60Co-γ射線輻照能顯著降低HIEC細(xì)胞外代謝物中SOD、GSH的含量(P<0.05)，而給予GA預(yù)處理能顯著減輕SOD、GSH下降的程度(P<0.05)，且以10 μmol/L 的GA預(yù)處理組作用最顯著。而10 μmol/L的GA預(yù)處理與輻照組相比，并未顯著降低MDA水平(P>0.05)。說明本實(shí)驗(yàn)條件下，GA能減輕輻照所致SOD、GSH下降的程度，但對(duì)降低輻照后HIEC細(xì)胞的MDA水平并未有明顯意義。

表1 GA對(duì)輻射損傷HIEC細(xì)胞SOD、MDA和GSH活性的影響

*P<0.05，與輻照組比較；#P<0.05，與對(duì)照組比較

3.5 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和激酶表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)用Western-Blot法檢測(cè)了GA對(duì)受照細(xì)胞Cyclin D1和CDK4蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖4 A、4 B、4 C顯示：與空白對(duì)照組相比，輻照引起Cyclin D1和CDK4水平下降， 照前給藥1 μmol/L 的GA預(yù)處理能顯著減輕Cyclin D1和CDK4水平下降的程度(P<0.05)，與輻照組相比(10、20)μmol/L 的GA預(yù)處理組能一定程度上抑制Cyclin D1和CDK4水平下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明GA可以推動(dòng)輻照所致HIEC細(xì)胞由 G1期進(jìn)入S期，而促進(jìn)照后細(xì)胞增殖[8]。

4 討論

電離輻射誘導(dǎo)的損害主要表現(xiàn)為DNA分子損傷、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、染色體畸變和細(xì)胞周期改變等方面，而對(duì)細(xì)胞膜的損害主要表現(xiàn)為輻射產(chǎn)物羥基和過氧自由基引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[1,3]。輻射防護(hù)劑的使用能一定程度減輕輻照所致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和細(xì)胞周期阻滯，而起到輻射防護(hù)作用。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：GA對(duì)HIEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用體現(xiàn)在時(shí)效性和量效性兩個(gè)方面。時(shí)效性表現(xiàn)為隨GA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GA對(duì)HIEC細(xì)胞的毒性作用增加，具體表現(xiàn)為：12 h內(nèi)低劑量組的GA可促進(jìn)HIEC 細(xì)胞的增殖率，無細(xì)胞毒性作用；作用后24 h和48 h，不同濃度GA組細(xì)胞的增殖率均低于正常對(duì)照組，且時(shí)間越長(zhǎng)，毒性越大。量效性表現(xiàn)為：在不同時(shí)間點(diǎn)(輻照后12、24、48 h)隨著GA濃度的增加，其細(xì)胞毒性作用增加；但在輻照后12 h組，0.1～20 μmol/L GA對(duì)HIEC細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，無毒性作用，且1、10、20 μmol/L GA組與對(duì)照組相比，HIEC細(xì)胞增殖率顯著上升(P<0.05)。

圖4 GA對(duì)受照HIEC細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4的影響 *P<0.05，與輻照組比較

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示：60Co-γ 射線單照組的HIEC細(xì)胞的克隆形成能力降低，與正常組相比，差異有顯著性(P<0.05)。細(xì)胞經(jīng)GA提前6 h預(yù)處理，能顯著提高細(xì)胞的克隆形成力。與60Co-γ 射線單照組比較，GA(1、10、20 μmol/L)預(yù)處理組，HIEC細(xì)胞的克隆形成能力顯著增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而1 μmol/LGA預(yù)處理組的細(xì)胞克隆形成能力增加效果最佳(P<0.05)。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：4 Gy60Co-γ射線照射條件下，照前6 h給予不同濃度 GA，能顯著提高HIEC細(xì)胞的增殖力，其中以1、 20 μmol/L GA作用效果最顯著。

與正常對(duì)照組相比，4 Gy的γ-射線輻照可顯著降低細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH的含量(P<0.05)，而給予GA預(yù)處理，則能顯著減輕細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH的下降(P<0.05)，且以10 μmol/L 的GA預(yù)處理組最顯著。而與輻照組相比，10 μmol/L 的GA預(yù)處理組能減輕細(xì)胞內(nèi)MDA水平的升高，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明GA可以降低電離輻射引起的細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。

細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞按照G1、S、G2、M、G1期的順序周期性運(yùn)轉(zhuǎn)。Cyclin D1作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDKs的調(diào)控者,與CDK4或CDK6結(jié)合并激活 G1 時(shí)期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1 期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的 Rb 蛋白從其所結(jié)合的 E2F 轉(zhuǎn)錄因子上解離，E2F 轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄活細(xì)胞周期的基因，從而推動(dòng)細(xì)胞周期由 G1 時(shí)期進(jìn)入到 S 時(shí)期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分裂。本研究證明，GA能減輕4 Gy60Co-γ射線暴露細(xì)胞Cyclin D1和CDK4水平的降低，促進(jìn)照后HIEC細(xì)胞增殖。

綜合上述研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：GA能減輕4Gy60Co-γ射線誘導(dǎo)的HIEC細(xì)胞損傷，促進(jìn)受照HIEC細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力的恢復(fù)，其機(jī)制可能與GA能降低電離輻射引起的氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和CDK4表達(dá)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提供了一種較為理想的輻射防護(hù)候選藥物，為進(jìn)一步探究其防護(hù)作用及作為臨床輻射防護(hù)藥物應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。