楊加偉，彭遼天，程小玲

（遵義醫(yī)科大學a.生物化學教研室；b.細胞生物學教研室，貴州遵義563006）

甲硫氨酸亞砜還原酶（Msr）是催化游離或多肽鏈中的甲硫氨酸亞砜（Met-O）還原為甲硫氨酸（Met）的一類酶[1，2]。目前報道的Msr可分為三類[3-4]：MsrA、MsrB和fRMsr，其中MsrB和fRMsr分別選擇性還原多肽鏈中的-Met-O和游離的-Met-O；而MsrA則選擇性的還原游離或者多肽鏈中構(gòu)型的Met-O。手性亞砜是一類含有亞硫?；?S=O）官能團的重要有機化合物，是很多藥物如質(zhì)子泵抑制劑埃索美拉唑、血小板粘附抑制劑OPC-29030、鉀通道激活劑Aprikalim等的關鍵組成部分[5-8]。利用生物酶選擇性地合成單一構(gòu)型的手性亞砜是目前的研究熱點，但高對映選擇性、高活性和高底物耐受的生物酶依然十分匱乏[9-11]。在本論文的前期工作中，項目組從一株假單胞菌中篩選出了一個MsrA基因并命名為MsrA[11，12]。利用MsrA重組蛋白為催化劑，有效實現(xiàn)了在底物濃度高達200mM下-構(gòu)型亞砜的高特異性合成，且產(chǎn)率接近理論最佳值[13]，展現(xiàn)出了良好的應用前景。但是，該酶還存在底物譜較窄，酶促反應受底物的限制較大等不足，需要對酶進行改造和優(yōu)化[13]。

定向進化是通過對蛋白質(zhì)編碼基因進行易錯PCR、DNA改組、定點飽和突變等方法進行連續(xù)的隨機突變、重組并通過高通量篩選方法獲得期望酶突變體的一種技術。定向進化技術作為改造酶分子的有效策略，現(xiàn)已廣泛應用在工業(yè)、環(huán)境以及醫(yī)藥等相關生物酶分子的改造領域[14-16]。由于定向進化技術需要對突變體庫進行大量的篩選，所以實現(xiàn)對酶定向進化改造的首要步驟就是建立起該酶的高通量活性篩選體系。因此，本研究基于前期研究結(jié)果及進一步研究的需要，擬建立一種高通量的MsrA的活性篩選體系，為其定向進化改造奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)與蛋白表達

1.2.2 重組菌細胞裂

1.2.3 MsrA活性測定應混合液于96孔酶標版，加入195L顯色液（50mM磷酸緩沖液，pH8.0，2mMDTNB），靜置于37℃反應30min后，用酶標儀測定各個樣品孔在412nm處的光吸收。以不含MsrA重組蛋白的細菌裂解液為空白對照，用空白對照與樣品OD412的差值衡量MsrA重組蛋白的活性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。利用獨立樣本T檢驗法計算兩個樣品間的差異顯著性，<0.05表示有統(tǒng)計學意義并用星號（*）標示。差異系數(shù)（coefficientofvariation)的計算方式為一組數(shù)據(jù)的標準差與其均值的百分比。

2 結(jié)果

2.1 MsrA基因工程菌微量培養(yǎng)體系的建立

因需要進行大規(guī)模的篩選，本研究首先需建立一種適用于96孔培養(yǎng)板的 MsrA基因工程菌培養(yǎng)和表達體系。經(jīng)過反復摸索，本研究選用單孔容積為2mL的96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基最終體積為1mL。為減少不同培養(yǎng)孔中由于細菌生長差異而導致的酶量差異，本研究先使用小體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌使其達到飽和。向每個培養(yǎng)孔中加入少量的LB培養(yǎng)基（0.3mL），將含MsrA重組質(zhì)粒的菌株單克隆依次挑取至各個培養(yǎng)孔中。37℃培養(yǎng)12h后，再加入大量（0.7mL）含誘導劑（IPTG）的新鮮培養(yǎng)基，誘導重組蛋白表達。結(jié)果顯示，經(jīng)過24h的誘導培養(yǎng)，每個培養(yǎng)孔中細菌的生長狀態(tài)良好，且差異較小。吸取一定量的菌液置于酶標儀進行OD600測量，結(jié)果顯示每個培養(yǎng)孔測得的OD600值差異較?。▓D1），經(jīng)統(tǒng)計分析，所有樣品的差異系數(shù)僅為8.0%。結(jié)果表明各個培養(yǎng)孔中的細菌生長一致性較好，成功建立了MsrA重組基因工程菌的微量培養(yǎng)體系。

圖1 96孔培養(yǎng)板細菌生長分析。虛線表示所有樣品的平均值

2.2 MsrA活性檢測體系的優(yōu)化

圖2 DTNB-DTT顯色法檢測MsrA重組蛋白酶活性。n=5，*表示與對照相比有統(tǒng)計學差異（<0.01）。

2.3 MsrA高通量活性篩選體系的確立

圖3 MsrA重組蛋白酶活性高通量檢測分析。虛線表示所有樣品的平均值

圖4 MsrA酶活性高通量篩選體系示意圖

3 討論

定向進化技術是對生物酶進行改造以提升其催化性能的有效手段，通過向模板序列中導入隨機突變，結(jié)合高通量篩選技術獲得期望的突變體[18]。和另一種常用的蛋白質(zhì)改造手段理性設計相比，定向進化技術特別適合于對結(jié)構(gòu)與功能了解較少的蛋白質(zhì)進行改造。理論上，通過大量反復的突變和篩選，任何蛋白質(zhì)都有可能得到進化和優(yōu)化。但在實際操作中，對大量突變體樣本的篩選往往是此項研究工作的基礎和瓶頸[19-21]。因此，建立合適的高通量活性篩選體系是利用定向進化技術對蛋白質(zhì)進行改造的基礎。

本課題組前期通過一系列的篩選與優(yōu)化，獲得了能高效制備手性亞砜的生物酶MsrA[13]，課題組接下來需對該酶進行定向進化改造以進一步提升其催化性能，為其將來的工業(yè)化應用打下基礎。由于前期對MsrA酶活性的篩選主要是利用氣相色譜及高效液相色譜法檢測底物的消耗量或者產(chǎn)物的生產(chǎn)量[13]，耗時且效率低，不能滿足高通量大規(guī)模篩選的要求.。因此課題組便開展了MsrA酶活性高通量篩選體系的研究。根據(jù)文獻報導[17]，MsrA反應體系中的DTT隨反應的進行而被消耗，由于DTT可和另一種物質(zhì)DTNB反應生成黃色的化合物，該化合物在412nm處有最大光吸收。因此，測定反應液在OD412處的光吸收變化情況，即可反映MsrA酶的催化活性。由于文獻中使用的是濃度較高的MsrA純酶，并不確定是否適用于MsrA粗酶液。特別是本研究的微量培養(yǎng)體系中，MsrA酶的含量非常低。因此，本研究在該方法基礎上進行了進一步的摸索和優(yōu)化。通過優(yōu)化重組菌株的培養(yǎng)方法以及顯色反應體系，最終借助酶標儀，實現(xiàn)了MsrA酶活性的高通量篩選。最終結(jié)果顯示，本研究測得不同培養(yǎng)孔中MsrA酶活性的一致性較好，能滿足后續(xù)酶定向進化改造研究的高通量篩選需求。

綜上所述，本研究成功建立了適用于定向進化改造的MsrA酶活性高通量篩選體系。