周 靜 ，葉朝暉，吳燕華

(寧波市婦女兒童醫(yī)院，浙江 寧波， 315010)

鐵破鑼(BeesiacalthaefoliaMaxim.Ulbr.)系毛茛科升麻族鐵破鑼屬植物，是我國特有的一種民間常用草藥，藥理活性主要有抗炎、抗腫瘤、抑制核苷酸轉(zhuǎn)運等[1]。有研究[2-5]表明，從產(chǎn)于云南的鐵破鑼根莖中分離得到4個三萜皂苷(beesiosideⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，而后鞠建華[6-9]等又從貴州省凡凈山和甘肅省文縣產(chǎn)的鐵破鑼中分離并鑒定了24個cycloartane型三萜皂苷類化合物。前期研究結(jié)果表明HPLC具有操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點[10-12]。但是由于皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)比較相近，極性較大，且無紫外吸收，應(yīng)用紫外檢測器檢測該成分時往往靈敏度偏低，很難對其進(jìn)行定量研究，因此，選用ELSD檢測器對該成分的含量進(jìn)行檢測。本實驗首次同時測定了從鐵破鑼中提取出來的3種三萜皂苷(BeesiosideⅠ、Ⅱ、Ⅲ)的含量，并對此進(jìn)行了方法學(xué)的考察，以期為鐵破鑼藥材的質(zhì)量控制提供一種可行的分析方法。

近年來中外學(xué)者對鐵破鑼的研究越來越多，對化學(xué)成分的研究也越來越深入，但對于鐵破鑼三萜皂苷的體外抗氧化研究罕有報道，本研究通過對鐵破鑼中三萜皂苷清除2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS+)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羥基自由基，以及對Fe2+的還原能力進(jìn)行研究，探討其體外抗氧化性，為后續(xù)深入探討其藥理活性提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器

LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)(島津)；SEDEX 75 蒸發(fā)光散射檢測器(法國)，XWK-3A 空氣泵；色譜柱COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6 ID × 250 mm)；FA 2004 電子天平(上海衡平儀器儀表廠)；FW80 型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；752紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；數(shù)顯pH計(上海天達(dá)儀器有限公司)。

1.2 試藥

乙腈、甲醇(GR，美國TEDIA天地制劑有限公司)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；BeesiosidesⅠ、Ⅱ、Ⅲ均為實驗室自制(高效液相測定法，純度 > 98%，結(jié)構(gòu)見圖1)；ABTS、DPPH(Sigma公司)；鐵破鑼藥材采自云南省，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮副教授進(jìn)行鑒定；人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉公司；其余試劑均為分析純。

圖1 Beesiosides Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)圖

2 方法與結(jié)果

2.1 鐵破鑼中三萜皂苷的含量測定

2.1.1試劑的配制

5%香草醛-冰醋酸溶液配制：精密稱取0.5000 g香草醛于10 ml容量瓶中，加入冰醋酸定容至刻度線。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密稱取人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品0.0043 g，置于10 ml的容量瓶中，加75%甲醇溶解至刻度線搖勻，制成0.43 mg/ml的溶液。

2.1.2鐵破鑼中三萜皂苷的制備

精密稱取5.000 g鐵破鑼粉末(過四號篩)，提取溶劑為75%甲醇，料液比為1:70，提取溫度為85 ℃，加熱回流法提取2 h，提取2次，過濾，濃縮，然后通過真空冷凍干燥機制得凍干粉備用。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml置于10 ml試管中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成不同濃度的溶液，揮干，精密加入0.2 ml 5%香草醛-冰醋酸和0.8 ml的高氯酸，60 ℃水浴15 min，冰水浴3 min，再加入5 ml無水乙酸，搖勻，在檢測波長550 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.4含量測定

精密稱取鐵破鑼總皂苷凍干粉5 mg，用75%甲醇定容至10 ml，混勻即得供試品溶液。取供試品0.5 ml置于10 ml的帶刻度具塞試管中，揮干，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作。

實驗結(jié)果表明：通過紫外顯色法對鐵破鑼中三萜皂苷進(jìn)行含量測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0011X-0.0022，r=0.9995，鐵破鑼中三萜皂苷含量為17.87%。

2.1.5方法學(xué)考察

(1)重復(fù)性試驗：平行稱取上述鐵破鑼總皂苷凍干粉6份，按照“2.1.3”項方法進(jìn)行重復(fù)測定，結(jié)果RSD為1.07%，表明該方法重復(fù)性較好。

(2)穩(wěn)定性試驗：分別在0、2、4、6、8、10 h對供試品進(jìn)行吸光度測定，結(jié)果RSD為0.85%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

(3)回收率試驗：取6份已知含量的鐵破鑼總皂苷凍干粉通過添加100%含量的人參皂苷Rg1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率試驗，結(jié)果RSD為1.93%，表明該方法回收率良好。

2.2 鐵破鑼中Beesiosides Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種三萜皂苷成分的含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-水(67：33)，流速1 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。ESLD檢測器條件，漂移管溫度64 ℃，載氣(空氣)，氣體壓力3.1 MPa。

2.2.2對照品溶液的制備

分別取BeesiosideⅠ、Ⅱ、Ⅲ對照品適量，精密稱定(12.84、10.24、16.02 mg)置于4 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，配成濃度分別為3.21、2.56、4.01 mg/ml的對照品儲備液；分別精密移取上述對照品溶液0.5、0.9、1.5 ml于容量瓶中搖勻，即得混合對照品儲備液，于4 ℃保存?zhèn)溆??；旌蠈φ掌啡芤褐蠦eesiosides Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的濃度分別為0.55、0.79、2.07 mg/ml。

2.2.3供試品溶液的制備

精密稱取0.4000 g鐵破鑼粉末(過四號篩)，75%甲醇為提取溶劑，料液比為1∶70，提取溫度為85 ℃，加熱回流提取2 h，提取2次，過濾，合并濾液，蒸干，用甲醇溶解并定容至2 ml量瓶中，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾后備用。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品儲備液1000、500、250、125、62.5 μl置于1 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得6個不同濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取6個不同濃度的混合對照品溶液各20 μl，依“2.2.1”項下色譜條件測定，以峰面積數(shù)值為縱坐標(biāo)，濃度數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定定量限(LOQ = 10×SD/S)和檢測限(LOD = 3.3×SD/S)，其中SD表示標(biāo)準(zhǔn)方差，S表示回歸方程斜率。

2.2.5含量測定

采用上述所建立的分析方法對鐵破鑼中BeesiosidesⅠ、Ⅱ、Ⅲ 3種三萜皂苷成分進(jìn)行測定，計算其含量。結(jié)果如圖2所示，通過HPLC-ELSD首次同時測定鐵破鑼中三種三萜皂苷成分，分別為BeesiosidesⅠ、Ⅱ、Ⅲ，三種化合物結(jié)構(gòu)如圖1所示，并對其含量進(jìn)行測定。

BeesiosidesⅠ、Ⅱ、Ⅲ 3種對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示，r均大于0.999，結(jié)果表明各組分在進(jìn)樣量范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好。通過此方法測得BeesiosideⅠ含量為0.18%，Beesioside Ⅱ含量為0.20%，Beesioside Ⅲ含量為0.45%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品(A)和鐵破鑼中3種三萜皂苷(B)高效液相色譜圖 1.Beesiosides I；2.Beesiosides II；3.Beesiosides III

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢測限和定量限

2.2.6方法學(xué)考察

(1)精密度試驗：精密量取混合對照品儲備液500 μl于1 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，依“2.2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各對照品峰面積，并求RSD值。結(jié)果表明：通過計算各對照品峰面積，RSD值分別為1.77%、1.57%、1.09%，均小于3%，表明儀器精密度良好。

(2)穩(wěn)定性試驗：精密量取同一供試品溶液，分別在制備后的0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄各組峰面積，計算RSD值。結(jié)果表明：通過計算各組峰面積，RSD值分別為1.00%、1.23%、1.72%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

(3)重復(fù)性試驗：取同一批鐵破鑼粗粉6份，精密稱定，按“2.2.3”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄各組峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線之后，計算含量和RSD值，結(jié)果表明：各組的RSD值分別為1.67%、1.85%、1.25%，表明該方法的重復(fù)性良好。

(4)加樣回收率試驗：取已知含量的同一批次鐵破鑼粉末共6份，精密稱定，分別根據(jù)藥材中各成分含量加入100%濃度含量的對照品粉末，按照“2.2.3”項方法制備供試品溶液，記錄各組峰面積，并計算加樣回收率及RSD值。結(jié)果如表2所示，1～6組RSD值分別為0.79%、0.95%、1.41%、0.72%、0.59%、0.76%，結(jié)果表明該方法加樣回收率良好。

表2 鐵破鑼中3種三萜皂苷成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.3 鐵破鑼中三萜皂苷體外抗氧化性研究

2.3.1清除ABTS+自由基的能力測定[13]

配制不同濃度梯度樣品溶液，分別加入0.4 ml于試管中，ABTS+自由基儲備液用70%乙醇稀釋40倍，再加入3.6 ml上述溶液于試管中，混勻后，避光放置10 min，在檢測波長734 nm處，測定吸光度，記吸光值為Ai，對照管為70%乙醇，測得的吸光值記為Aj，陽性對照品為維生素C(Vc)，計算試樣清除ABTS+的IC50。公式如下：

清除率(%)=[1-(Ai/Aj)]×100

(1)

結(jié)果表明(見圖3)：鐵破鑼中三萜皂苷有效抑制ABTS+的產(chǎn)生，其IC50分別為58.83 μg/ml，陽性對照Vc的IC50=56.25 μg/ml。由于IC50值越小，抗氧化能力越強，說明鐵破鑼中三萜皂苷具有較強清除ABTS+的能力。

圖3 鐵破鑼中三萜皂苷對ABTS+自由基的清除能力

2.3.2清除DPPH·能力的測定[13]

用無水乙醇配制成2×10-4mol/ L的DPPH溶液。取等體積待測液及上述溶液加入同一具塞試管中，搖勻。室溫避光放置30 min，在檢測波長517 nm處測定吸光度，用無水乙醇做參比溶液，吸光度記為Ai，分別測定2×10-4mol/L DPPH溶液、待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度，記為Ac和Aj，陽性對照品為Vc。公式如下：

(2)

結(jié)果表明：由圖4可知，鐵破鑼中三萜皂苷有效抑制DPPH·的產(chǎn)生，其IC50分別為54.43 μg/ml，陽性對照Vc的IC50=55.28 μg/ml。說明鐵破鑼中三萜皂苷具有較強清除DPPH·的能力。

圖4 鐵破鑼中三萜皂苷對DPPH·的清除能力

2.3.3清除羥基自由基能力的測定[14]

取1.2 ml結(jié)晶紫溶液和0.2 ml硫酸亞鐵溶液于比色皿中，在檢測波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)0；加入0.16 ml 0.05% H2O2溶液，測定510 nm處吸光值A(chǔ)1；向上述溶液體系中分別加入不同濃度樣品以及Vc溶液，空白組為同體積蒸餾水，用pH=4的Tris-HCl緩沖液稀釋至20 ml，室溫避光5 min，測得吸光度A2，計算試樣清除羥基自由基的IC50，公式如下：

(3)

結(jié)果表明(見圖5)：鐵破鑼中三萜皂苷有效抑制羥基自由基的產(chǎn)生，其IC50分別為85.43 μg/ml，陽性對照Vc的IC50=62.86 μg/ml。說明鐵破鑼中三萜皂苷具有較強清除羥基自由基的能力。

圖5 鐵破鑼中三萜皂苷對羥基自由基的清除能力

2.3.4總抗氧化能力(FRAP)的測定[14]

吸取100 μl不同濃度的FeSO4溶液(0、100、200、400、600、800、1000 μmol/L)，加入3 ml FRAP試劑溶液，然后加入300 μl蒸餾水，于37 ℃水浴中反應(yīng)4 min，在593 nm測定吸光度，以FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定樣品的吸光度值，并求出待測樣品相應(yīng)的FeSO4濃度，定義為當(dāng)量濃度(FRAP值)。

結(jié)果得到FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：Y=0.0007X-0.0198，r=0.9989，表明FeSO4在100～1 000 μmol/L濃度范圍內(nèi)與吸光度有較好的線性關(guān)系；由圖6可知，隨著濃度的升高鐵離子還原能力增強，且存在明顯的劑量依賴性，說明鐵破鑼中三萜皂苷總的抗氧化能力較強。

圖6 鐵破鑼中三萜皂苷總的抗氧化能力

3 討論

鐵破鑼主要分布于我國云南西北部、四川、貴州、廣西北部、湖南西部、湖北西部、陜西南部及甘肅南部，資源豐富，但對該植物的開發(fā)研究還處于初級階段，尚待進(jìn)一步努力，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代藥理研究結(jié)果與傳統(tǒng)中草藥經(jīng)驗，開發(fā)出新型的藥品服務(wù)于社會。民間將鐵破鑼根莖或全草藥用，具有清熱解毒，涼血，活血，消腫，鎮(zhèn)痛，散風(fēng)寒的功效，用來治療風(fēng)寒感冒，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，紅白痢疾，咽喉腫疼，頭痛，牙痛等病，外敷治療瘡癤和毒蛇咬傷等[15]。從鐵破鑼中分離出大致三種類型的化學(xué)成分，即三萜及甾醇類、有機酸類和三萜皂苷類，無論全草或根莖,其三萜皂苷類化學(xué)成分都占絕對優(yōu)勢,是鐵破鑼的主要成分。

本研究首次建立HPLC-ELSD法同時測定鐵破鑼藥材中的三萜皂苷的含量，該方法線性關(guān)系良好、精密度好、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高，且簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。通過體外抗氧化性研究，證明鐵破鑼中三萜皂苷能夠有效清除ABTS+、DPPH·和羥基自由基，并且具有很好的抗氧化能力，對于進(jìn)一步開發(fā)抗氧化保健新藥提供較強的應(yīng)用前景。