滿 緩，張 鳳，黃豆豆，熊筱娟，詹 勤，廖麗娜，李鐵軍，陳萬生

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥材科，上海 200003；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000; 3.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，上海 200433)

阿霉素屬于蒽環(huán)類抗癌藥[1]，對白血病、前列腺癌、肝癌等實體瘤有非常明確的療效[2]，但在臨床應(yīng)用中會產(chǎn)生心臟毒性的副作用，隨著使用劑量的增加，可使得心肌產(chǎn)生不可逆性損傷，最終發(fā)展成為充血性心力衰竭[3]。近年來對阿霉素所致心臟毒性的機(jī)制考察主要著重于自由基、鈣超載、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等方面[4]。已有實驗結(jié)果顯示，阿霉素可使心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加[5]。有學(xué)者研究表明，阿霉素可使心肌細(xì)胞中鈣離子濃度升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變[6]，但阿霉素的心臟毒性機(jī)制尚未有明確的定論[7]。如何在應(yīng)用阿霉素治療腫瘤時又能減少其心臟毒性，尋找對其有效的防護(hù)藥物，具有重大臨床意義。

升陷湯為近代著名中醫(yī)學(xué)家張錫純先生所創(chuàng)，記載于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，組方配比為黃芪∶柴胡∶升麻∶知母∶桔梗=6∶1.5∶1∶3∶1.5[9]。方中生黃芪補(bǔ)氣升陷為主藥，知母涼潤制主藥之溫燥，柴胡、升麻助黃芪升陷之力，桔梗載藥力上達(dá)胸中，共奏升補(bǔ)大氣之效[10]。目前臨床用于治療冠心病心絞痛、慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病，應(yīng)用十分廣泛[12]。但尚未見應(yīng)用于阿霉素或其他抗腫瘤藥物心臟毒性的治療，故本實驗采用阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，考察升陷湯及各單味藥對阿霉素心臟毒性的影響。

1 材料和儀器

1.1 實驗動物

采用3 d的SD乳鼠(雌雄不限)，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，常規(guī)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)。許可證號SYXK(滬)2007-0005，所有實驗動物均獲得第二軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會的準(zhǔn)許。

1.2 實驗試劑與儀器

黃芪、知母、柴胡、升麻和桔梗飲片(上海長征醫(yī)院藥材科)；Milli-Q純凈水(美國Millipore)；Fura-2/AM(中國科學(xué)院上海生理所)；生理鹽水(上海長征醫(yī)院提供)；0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)及小牛血清(FCS，美國Gibco公司)；MTT工作液(美國sigma公司)；二甲基亞砜(德國GmbH公司)；LDH試劑盒(南京建成公司)；DCFH-DA、Fluo-3 AM(碧云天生物有限公司)；D-Hanks緩沖液(上海研卉生物科技有限公司)；PBS緩沖液(南京滴純生物科技有限公司)；其他試劑為分析純。

多功能酶標(biāo)儀(美國Multiskan MK3)；倒置熒光顯微鏡(重慶光學(xué)儀器)；低溫冰箱(海爾集團(tuán))；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；無菌操作超凈臺(蘇州凈化設(shè)備公司)；LD4-2型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；79-1型磁力攪拌器(江蘇周莊科研儀器廠)；YJ-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)。

1.3 樣品制備

1.3.1升陷湯全方提取物(藥物SXT)

升陷湯組方飲片(黃芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g和升麻100 g)，先加入5 L的水浸泡24 h后，再煎煮，重復(fù)3次，將濃縮水煎煮液合并至650 ml，按原生藥量將濃度記為2.0 g/ml。水煎液放置在4 ℃冰箱，冷藏備用。

1.3.2單味藥材提取物

升陷湯組方各單味藥材，制備方法同“1.3.1”，得黃芪(藥物A)、知母(藥物B)、柴胡(藥物C)、桔梗(藥物D)和升麻(藥物E)提取物。

2 試驗方法

2.1 原代心肌細(xì)胞的提取和純化

參考文獻(xiàn)的制作方法[13]，取出生1～3 d的SD乳鼠，先用75%的酒精消毒，在無菌條件下開胸取出心臟，放入預(yù)冷的1×D-Hanks緩沖液中，洗滌2～3次，取心尖部組織剪為1 mm3左右的碎塊，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.08%胰蛋白酶溶液消化7 min，待自然沉淀后棄上清液一次，以后每次取上清液，加含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。重復(fù)此步驟直至組織塊消化完全。中和的上清液1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用培養(yǎng)基再洗一遍，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，用含10%的FBS和10%的FCS的DMEM培養(yǎng)基重懸后，采用差速貼壁法純化細(xì)胞2次，每次45 min，取細(xì)胞懸液，鋪板，每毫升細(xì)胞數(shù)5×105。鋪板，放入5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)直到心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)搏動。

2.2 阿霉素心臟毒性模型復(fù)制和藥物干預(yù)

收集生長健康的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為8組。正常對照組(Con 組)，健康的心肌細(xì)胞；模型組(M組)，用阿霉素終濃度500 ng/ml，孵育24 h造心肌細(xì)胞損傷模型；藥物干預(yù)組(SXT、A、B、C、D和E)，用阿霉素終濃度500 ng/ml，孵育24 h造心肌細(xì)胞損傷模型，在孵育的同時加入升陷湯全方提取物、各單味藥材提取物，藥物濃度分別為75 μg/ml和150 μg/ml。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1藥物對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞活力的影響

細(xì)胞鋪96孔板培養(yǎng)，2～4 d后，心肌細(xì)胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，取出每孔加入MTT(5 mg/ml)應(yīng)用溶液20l，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，取出去除培養(yǎng)基，加入150l的DMSO，用酶標(biāo)儀充分震蕩5 min，在492 nm波長下讀數(shù)，測定各孔吸光度OD值。細(xì)胞存活率=(試驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

2.3.2藥物對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞LDH的影響

細(xì)胞鋪96孔板培養(yǎng)，2～4 d后，心肌細(xì)胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，吸出100l培養(yǎng)液，放入到一新的96孔板相應(yīng)孔中。按照試劑盒說明書分為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、藥品孔、對照孔，在不同相應(yīng)的對照孔中加入不同的試劑(雙蒸水、0.2 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液、待測藥物組、基質(zhì)緩沖液、輔酶I)，混勻，37℃溫浴15 min，之后加入2,4-二硝基苯肼25l，混勻，37 ℃溫浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH溶液250l，混勻，室溫放置5 min，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀數(shù)，測定各孔吸光度OD值。計算公式：細(xì)胞上清液中LDH活性(U/L)=(測定OD值-對照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2 mmol/L)1 000。

2.3.3藥物對阿霉素?fù)p傷心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧和鈣離子濃度的影響[14]

原代心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和鈣離子濃度檢測分別采用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光探針ROS(DCFH-DA)和鈣離子濃度(Fluo-3 AM)的熒光強(qiáng)度。細(xì)胞鋪96孔板培養(yǎng)，2～4 d后，心肌細(xì)胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，加入稀釋好的含有DCFA-DA(Fluo-3 AM)的無血清的DMEM，37℃繼續(xù)孵育30～60 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，在多功能酶標(biāo)儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm下檢測細(xì)胞內(nèi)熒光。以模型組為對照組，其余組與模型組的比值為其相對熒光數(shù)值。

2.3.4統(tǒng)計學(xué)處理方法

3 實驗結(jié)果

3.1 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的影響

MTT結(jié)果顯示阿霉素刺激心肌細(xì)胞24 h后，能顯著降低細(xì)胞活力。當(dāng)同時給與升陷湯及各單味藥治療后，在濃度為75g/ml時，升陷湯全方以及黃芪、知母、桔梗單味藥能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；柴胡、升麻單味藥雖也增加了細(xì)胞活力，但與模型組比較差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義；在濃度為150g/ml時，與模型組比較，升陷湯及各單味藥均能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明在75g/ml、150g/ml濃度時，升陷湯全方以及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用(圖1)。

圖1 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷模型的影響 *P<0.05與模型組比較；##P<0.01與正常組比較

3.2 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

結(jié)果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，當(dāng)給予升陷湯及各單味藥治療后，在藥物濃度75g/ml時，除升陷湯全方，各單味藥均可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在藥物濃度150g/ml時，升陷湯全方和各單味藥均可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明升陷湯全方及單味藥可以降低阿霉素引起的心肌細(xì)胞內(nèi)升高的鈣離子濃度，具有保護(hù)心肌細(xì)胞損傷作用(圖2)。

3.3 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞內(nèi)LDH含量的影響

結(jié)果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞LDH濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，當(dāng)同時給予升陷湯及各單味藥治療后，在濃度為75g/ml、150g/ml時，升陷湯全方及各單味藥(除黃芪外)均能夠降低細(xì)胞LDH的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明升陷湯全方及單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用(表1)。

圖2 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響 *P<0.05，**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

3.4 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

結(jié)果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，當(dāng)同時給予升陷湯及各單味藥治療后，在藥物濃度75g/ml時，升陷湯、知母和柴胡可以降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，差異明顯；在藥物濃度150g/ml時，升陷湯、黃芪、知母、柴胡可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，桔梗、升麻對ROS的濃度無影響(圖3)。

表1 藥物對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷LDH的影響

*P<0.05，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

圖3 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 *P<0.05、**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

4 討論

蒽環(huán)類藥物為臨床上抗腫瘤常用的藥物，對血液系統(tǒng)以及各種實體瘤有較好的治療效果[15]，阿霉素是其代表藥物，已廣泛應(yīng)用于臨床上一些癌癥的治療，并取得了顯著的療效，延長了患者的生命，并提高了其生活質(zhì)量，但阿霉素帶來的心臟毒性、骨髓抑制、消化道損傷等副作用，使得阿霉素的臨床應(yīng)用受到一定限制[16]。其中，由于阿霉素與心肌細(xì)胞具有較高的親和力，其導(dǎo)致的心臟毒性也成為最嚴(yán)重的毒性反應(yīng)[15]。阿霉素進(jìn)入體內(nèi)后，一方面，在線粒體和微粒體中導(dǎo)致一系列的自由基和超氧化物的生成，可與體內(nèi)的有機(jī)物及一些生物膜發(fā)生反應(yīng)，從而改變生物膜的流動性，進(jìn)而損傷細(xì)胞的功能[4]，另一方面，可引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，從而造成心肌細(xì)胞代謝紊亂以及能量代謝障礙。

臨床上升陷湯廣泛用于冠心病、心絞痛的治療，慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病[17]，但升陷湯所帶來的心肌細(xì)胞損傷也不容忽視。有報道稱，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，會降低細(xì)胞的抗氧化能力[18]，會產(chǎn)生細(xì)胞的凋亡[19]。LDH含量的增加提示，心肌細(xì)胞在使用阿霉素的情況下，發(fā)生了細(xì)胞的過氧化過程，而LDH的含量也是對心肌細(xì)胞損傷的提示[20]。Ca2+的增多，會使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，產(chǎn)生心律失常[21]。

本課題通過體外細(xì)胞實驗從阿霉素致心肌細(xì)胞損傷，基于心肌細(xì)胞凋亡角度考察，證實了升陷湯以及各單味藥的保護(hù)作用，可通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH水平以及Ca2+的濃度實現(xiàn)，在早期阿霉素治療中如果應(yīng)用升陷湯，一定程度上能降低阿霉素的心臟毒性作用。在本次實驗中升陷湯全方在降低細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH和提高生存率方面明顯強(qiáng)于其他任何單味藥材處理組，部分證實了升陷湯全方治療“大氣下陷”的合理性，但實驗中缺少對不同藥材組合的考察去證實君臣佐使的配伍機(jī)制，需要在后期實驗進(jìn)行彌補(bǔ)。本實驗結(jié)果為阿霉素導(dǎo)致的心臟毒性提供了新的治療思路，但離體實驗與在體情況仍有許多差別，實驗結(jié)論還需進(jìn)一步在在體實驗中證實。