黃祖波， 沈崇坤， 馮會(huì)婷， 侯雪楠， 吳文如， 張軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東中山 528400；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006）

KBN觸變凝膠劑[1]是本課題組立足于“優(yōu)化處方，優(yōu)化劑型”對(duì)治療外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）的中藥新藥開(kāi)展持續(xù)研究而獲得的一種新型中藥制劑。該制劑由黃連、三白草、雞冠花、大青葉、苦參、百部、龍膽、香薷、丁香、冰片10味中藥材組成，具有清熱解毒、祛濕止帶、殺蟲(chóng)止癢之功，臨床用于治療霉菌性陰道炎。前期研究已證實(shí)該制劑具備優(yōu)良的抑殺白色念珠菌功效，但其抗炎效果及作用機(jī)制尚不明確?？寡鬃饔檬切滤幩幮W(xué)評(píng)價(jià)的重要組成內(nèi)容?；诖耍狙芯繑M通過(guò)建立大鼠足腫脹模型及小鼠急性耳腫脹模型，評(píng)價(jià)KBN觸變凝膠劑的抗炎作用，并從核因子kappaB（NF-κB）信號(hào)通路調(diào)控局部組織中炎癥相關(guān)蛋白和因子的表達(dá)水平，初步探討其作用機(jī)制，以期為KBN觸變凝膠劑的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠，180～220 g，SPF級(jí)KM雌性小鼠，18～22 g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0034。

1.2 藥物及試劑 凝膠基質(zhì)KBN觸變凝膠劑為南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院中試研究制備產(chǎn)品；地塞米松（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：1802013H）。角叉菜膠（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBR0530V）；大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180619、20180616）；RIPA Lysis Buffer（CWBIO公司，批號(hào)：01408/40313）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠抗兔二抗（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：77K00113）；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（聯(lián)科生物，批號(hào)：71708373）；核因子NF-κB p65抗體（批號(hào)：AF5006）、抑制因子 IκB-α 抗體（批號(hào)：AF5002）、COX-2抗體（批號(hào)：AF7003）、Tubulin抗體（批號(hào)：AF7010）、GAPDH抗體（批號(hào)：AF7021）均購(gòu)自于美國(guó)Affinity公司；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140412）；二甲苯（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20160201-2）；4%多聚甲醛（合肥biosharp公司，批號(hào)：1807949）；OCT包埋劑（日本Sakura公司，批號(hào)：4583）；EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液（武漢Servicebio公司，批號(hào)：G1203）；DAB顯色劑組化試劑盒（武漢Servicebio公司，批號(hào)：G1211）。

1.3 儀器 PV-200型足容積測(cè)定儀（成都泰盟軟件有限公司）；KOC-220HR型低溫冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)PerKinElmer公司）；電泳儀、濕法電轉(zhuǎn)裝置、化學(xué)發(fā)光儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ZD-8800型水平脫色搖床（華利達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器公司）；勻漿機(jī)（美國(guó)Sonics公司）；PB-303N型電子天平（美國(guó)Mettler-Toledo公司）；老皮匠牌6 mm耳片打孔沖頭；微量進(jìn)樣器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；PB-303N型電子天平（美國(guó)METTLER TOLEDO公司）；JJ-12J型脫水機(jī)、JBP5型包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；XSP-C204型顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）。

1.4 抗大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[2，3]方法，將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組（涂抹凝膠基質(zhì)）、地塞米松組（涂抹復(fù)方醋酸地塞米松乳膏），KBN低、中、高劑量組（涂抹KBN觸變凝膠劑，生藥質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g·mL-1）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將各組大鼠右后肢外側(cè)脫毛處理后，空白組不作任何處理，其他各組右后下肢外側(cè)涂抹相應(yīng)的藥物。給藥后用醫(yī)用膠布覆蓋1 h，每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，使用足容積測(cè)定儀測(cè)量每只大鼠右后足正常足容積（V/mL）作為致炎前（0 h）數(shù)據(jù)，隨后將1%角叉菜膠（0.1 mL/只）注入大鼠右后足腳墊皮下，再分別測(cè)量致炎后0.5、1、2、3、4、6 h大鼠右后足容積。致炎6 h完畢后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（劑量：0.3 mL/100 g體質(zhì)量），腹主動(dòng)脈取血，分離血清，剝離足部致炎部位軟組織，樣本于-80℃保存?zhèn)溆?。按以下公式?jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的足腫脹度：足腫脹度=致炎后足容積-致炎前足容積。

1.5 采用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)足跖腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 取足跖腫脹模型大鼠血清解凍后3 000 r·min-1離心30 s，具體操作步驟嚴(yán)格按照TNF-α、IL-1β檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)足跖腫脹模型大鼠足部軟組織 NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá) 稱取適量足跖腫脹模型大鼠足部軟組織，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白總濃度。取蛋白上樣量50 μg，以10%SDSPAGE后濕法轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶封閉1.5 h，洗滌。加入兔抗鼠NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、 COX-2（1∶1 000）、 Tubulin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）多克隆抗體，并置于4℃振蕩孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，HRP化學(xué)發(fā)光底物曝光，用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)顯影并采集保存圖像數(shù)據(jù)，用Image Lab圖像分析軟件，分析條帶蛋白灰度值。

1.7 抗小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[4]方法，取60只小鼠，稱質(zhì)量后隨機(jī)分成6組，分組方法同“1.4”項(xiàng)。于每只小鼠右耳廓的內(nèi)外兩面均勻涂搽對(duì)應(yīng)藥物溶液約0.05 mL/20 g體質(zhì)量，每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥30 min后，用蒸餾水洗去右側(cè)耳廓藥液并拭干，吸取二甲苯40 μL均勻涂布于小鼠右耳兩面引起炎癥30 min。將小鼠斷頸處死，迅速剪下左、右兩耳，用直徑6 mm打孔沖頭于相同位置打下兩側(cè)圓形耳片，稱質(zhì)量記錄后浸入40 g/L多聚甲醛固定48 h備用。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα的表達(dá) 取耳片組織，梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋，切片，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉。加入抗體孵育：一抗為兔抗鼠NF-κB p65、IκBα多克隆抗體，稀釋濃度均為1∶100，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，稀釋濃度為1∶200。DAB顯色后復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。圖像分析判讀：蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色，在高倍視野（40×10）的光鏡下，隨機(jī)選擇10個(gè)具有代表意義的視野，計(jì)算每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞（取均數(shù)），并觀察細(xì)胞顯色深淺。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析。方差齊時(shí)，組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，組內(nèi)兩兩多重比較采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KBN觸變凝膠劑對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 表1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠足容積隨時(shí)間逐步增大；造模后0.5～6 h，與模型組比較，KBN高劑量組大鼠足腫脹度降低（P＜0.05或P＜0.01），KBN低劑量和中劑量組有減小趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。KBN各劑量組足腫脹度與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.2 KBN觸變凝膠劑對(duì)足跖腫脹模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響 表2結(jié)果顯示：與空白組比較，足跖腫脹模型組大鼠足部軟組織中TNF-α、IL-1β含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，KBN高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量顯著降低（P＜0.05），KBN中劑量組大鼠血清中IL-1β含量顯著降低（P＜0.05），KBN中劑量大鼠血清TNF-α含量及低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量有一定的降低趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明0.2～0.4 g·mL-1KBN觸變凝膠劑涂抹給藥能較好抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的促炎因子釋放，且呈劑量依賴性。

表1 KBN觸變凝膠劑對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

表1 KBN觸變凝膠劑對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組造模后6 h 0.00±0.02 1.04±0.31①0.79±0.14③1.01±0.14 0.98±0.10 0.89±0.16②足腫脹度0 h 000000造模后0.5 h 0.00±0.01 0.42±0.17①0.25±0.19③0.44±0.09 0.45±0.20 0.30±0.19②造模后1 h 0.00±0.02 0.69±0.32①0.43±0.16③0.65±0.13 0.68±0.25 0.51±0.20②造模后2 h 0.00±0.02 0.86±0.30①0.55±0.16③0.80±0.14 0.80±0.27 0.77±0.27②造模后3 h 0.01±0.02 0.98±0.31①0.67±0.18③0.88±0.16 0.91±0.22 0.79±0.26②造模后4 h 0.00±0.02 1.08±0.33①0.83±0.18③0.97±0.23 0.96±0.22 0.89±0.17②

表2 KBN觸變凝膠劑對(duì)足腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

表2 KBN觸變凝膠劑對(duì)足腫脹模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影響Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

IL-1β 61.75±19.97 245.37±66.86①111.74±39.86③163.01±77.90 152.65±34.77②149.85±43.75②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 TNF-α 29.0±3.20 155.91±16.37①117.16±17.50③143.84±27.50 130.81±15.68 123.56±17.23②

2.3 KBN觸變凝膠劑對(duì)足腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá)的影響 圖1、表3結(jié)果顯示：與空白組比較，角叉菜膠致足跖腫脹模型組大鼠足部軟組織中NF-κB p65、COX-2表達(dá)顯著增高（P＜0.05），IκBα表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，KBN高劑量組大鼠足部軟組織中NF-κB p65、COX-2表達(dá)顯著下降（P＜0.05或P ＜0.01）、IκBα表達(dá)顯著上升（P＜0.05），KBN中劑量和低劑量組NF-κB p65、COX-2表達(dá)有下降趨勢(shì)，IκBα表達(dá)有上升趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。KBN各劑量組大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá)與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明NF-κB/IκB信號(hào)通路可能介導(dǎo)了KBN觸變凝膠劑的抗炎作用，且呈劑量依賴性。

圖1 KBN觸變凝膠劑對(duì)足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of KBN Thixotropic Gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats

表3 KBN觸變凝膠劑對(duì)足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

表3 KBN觸變凝膠劑對(duì)足跖腫脹模型大鼠足部軟組織NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表達(dá)的影響Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

COX-2/GAPDH 0.123±0.021 0.918±0.048①0.665±0.197③0.860±0.101 0.857±0.115 0.715±0.085②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65/GAPDH 0.233±0.025 0.803±0.059①0.400±0.092③0.640±0.099 0.600±0.027 0.503±0.084②IκBα/Tubulin 0.943±0.055 0.208±0.029①0.868±0.120③0.313±0.042 0.463±0.010 0.508±0.154②

2.4 KBN觸變凝膠劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響 表4結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹程度顯著增大（P＜0.05）；與模型組比較，KBN高劑量組小鼠耳廓腫脹程度降低（P＜0.05）。KBN各劑量組小鼠耳腫脹程度與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑對(duì)二甲苯所致的小鼠急性炎癥耳腫脹具有抑制作用。

表4 KBN觸變凝膠劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

表4 KBN觸變凝膠劑對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

耳廓腫脹度（m/mg）0.233±0.224 6.167±1.905①0.533±0.312③5.189±2.504 4.233±1.973 3.900±1.491②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10

2.5 KBN觸變凝膠劑對(duì)耳廓腫脹模型小鼠耳部組織中NF-κB p65及IκBα表達(dá)水平的影響 圖2、圖3、表5結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組小鼠耳廓組織中NF-κB p65表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05）、IκBα表達(dá)水平顯著降低（P ＜ 0.01）。與模型組比較，KBN高、中劑量組的小鼠耳廓組織中NF-κB p65表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），KBN低劑量組NF-κB p65表達(dá)有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，KBN高劑量組的小鼠耳廓組織中IκBα表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），KBN中、低劑量組IκBα表達(dá)亦有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；KBN各劑量組小鼠耳部組織NF-κB p65、IκBα表達(dá)與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明KBN觸變凝膠劑可降低局部炎癥組織中NF-κB p65的表達(dá)，上調(diào)IκBα的表達(dá)，從而達(dá)到抗炎效果，且呈劑量依賴性。

圖2 KBN觸變凝膠劑對(duì)耳廓腫脹模型小鼠耳組織NF-κB p65表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of NF-κB p65 in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

圖3 KBN觸變凝膠劑對(duì)耳廓腫脹模型小鼠耳組織IκBα表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 3 The effect of KBN thixotropic gel on the expression of IκBα in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

3 討論

KBN觸變凝膠劑以“清熱解毒、利濕收斂、殺蟲(chóng)止癢”遣藥組方，方中重用黃連，佐以龍膽、百部、苦參、丁香、大青葉等多味中藥材，黃連的用量達(dá)到其發(fā)揮體外抗菌最佳藥效的適宜量。臨床應(yīng)用中，KBN觸變凝膠劑具有良好的抗炎消腫效果，能明顯改善婦科陰道炎、皮膚軟組織炎癥、接觸性皮膚炎等的炎癥癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，KBN觸變凝膠劑復(fù)方中一些活性成分具有明顯的抗炎作用，如小檗堿、丁香酚、黃芩苷、苦參堿等[5-8]。但KBN觸變凝膠劑在藥理實(shí)驗(yàn)中具有的抗急性炎癥效果及抗炎機(jī)制尚不明確。

表5 各組小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/個(gè)）

表5 各組小鼠耳廓組織中NF-κB p65及IκBα表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/個(gè)）

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

IκBα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)20.3±3.0 7.6±2.9①16.7±11.0③9.0±4.3 12.5±6.2 13.6±5.0②組別空白組模型組地塞米松組KBN低劑量組KBN中劑量組KBN高劑量組N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)2.0±0.7 14.4±3.4①3.6±1.1③10.0±2.4 6.5±2.5②4.8±2.2②

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)損傷因子所產(chǎn)生的一種特異性防御反應(yīng)，在損傷組織和血液中伴隨著復(fù)雜的多種炎癥介質(zhì)以及炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的波動(dòng)[9]。在眾多促炎性因子中，白介素-1β和腫瘤壞死因子-α是其中的關(guān)鍵因子[10]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞經(jīng)致炎因子刺激后所釋放的一種細(xì)胞因子，是一種促炎癥蛋白；IL-1β是一種炎性活細(xì)胞素，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，可刺激各種免疫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥蛋白和炎癥介質(zhì)的釋放，對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有趨化作用，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。環(huán)氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，包括COX-1/COX-2 2種存在形式，其中COX-2為誘導(dǎo)型，是經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，由各種損傷性化學(xué)、物理和生物因子均可誘導(dǎo)產(chǎn)生[11]，進(jìn)而催化PGs合成，參與并持續(xù)影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。

NF-κB信號(hào)通路是一條與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的信號(hào)通路。正常生理?xiàng)l件下，NF-κB與它的抑制蛋白（IκB）相結(jié)合在胞漿內(nèi)以無(wú)活性形式存在，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，Akt作為其重要的上游分子，可通過(guò)磷酸化IκB激酶促使后者降解IκB，使NF-κB與IκB分離并活化最終轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種分子如炎癥介質(zhì)、趨化因子、酶類等的表達(dá)，調(diào)節(jié)著炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[10]。抑制NF-κB信號(hào)通路，可抑制促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1β）、黏附因子、趨化因子、凝血因子等的過(guò)度合成與釋放，并且抑制與炎癥有關(guān)的基因表達(dá)，保護(hù)機(jī)體免受過(guò)度炎癥的傷害，因此，NF-κB被認(rèn)為是多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。

本課題組前期研究已通過(guò)體外抗真菌藥敏試驗(yàn)證實(shí)了KBN觸變凝膠劑在大于13.03 mg/mL生藥濃度時(shí)對(duì)白色念珠菌具有較佳的抑制作用，透射電鏡結(jié)果表明其可能是通過(guò)破壞白色念珠菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)而達(dá)到抗真菌作用。基于此，本研究從抗炎的角度進(jìn)一步展開(kāi)對(duì)KBN觸變凝膠劑的藥效研究。角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型和二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型是目前運(yùn)用較多且成熟的2種抗炎性藥理模型，常用于篩選和評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用，尤其是在我國(guó)傳統(tǒng)藥物的抗炎作用研究中起到了重要的作用[12]。本研究成功復(fù)制了角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型和二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型，通過(guò)與模型組比較，KBN觸變凝膠劑組足腫脹度與耳腫脹度顯著降低，具有確切的抗炎藥效。本研究進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白與相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與模型組比較，KBN觸變凝膠劑干預(yù)后大鼠血清中TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平均呈劑量依賴性下降，提示KBN觸變凝膠劑的抗炎作用與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β釋放有著密切關(guān)系。結(jié)果還表明KBN觸變凝膠劑能明顯抑制炎癥模型動(dòng)物NF-κB p65、COX-2的表達(dá)，上調(diào)IκBα表達(dá)，推測(cè)抑制NF-κB通路活化及COX-2表達(dá)，進(jìn)而減輕局部組織炎癥反應(yīng)，此極有可能是KBN觸變凝膠劑發(fā)揮抗炎作用的主要機(jī)制之一。

綜上所述，KBN觸變凝膠劑具有良好的抗炎作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路活化進(jìn)而降低炎癥因子的釋放有關(guān)。