覃玉冰， 林煒基， 曾廣必， 孫偉鵬， 張璐， 葉小衛(wèi)

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國肝癌死亡率極高，給社會和醫(yī)療帶來沉重的負擔[1]。大部分肝癌發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，無法接受根治性手術(shù)治療[2]?，F(xiàn)代中醫(yī)對肝癌治療強調(diào)“整體調(diào)治”、“扶正祛邪”，可以彌補西醫(yī)的許多不足[3]。

白花蛇舌草主要生長于我國江南及兩廣地區(qū)，味苦性寒，具有清熱解毒、散結(jié)止痛、利尿除濕的功效，是臨床治療肝癌的常用中藥。研究其單味藥抗肝癌的分子作用機制對探討肝癌病機及加減白花蛇舌草的中藥方劑的配伍有較大的意義?，F(xiàn)代研究表明，白花蛇舌草可通過多種途徑起到抗腫瘤作用[4]，但目前尚未全面地闡明其作用機制。

網(wǎng)絡藥理學能運用多種技術(shù)揭示“藥物—基因—靶點—疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關(guān)系[5]。因此，本研究應用網(wǎng)絡藥理學預測白花蛇舌草治療肝癌多靶標、多通路協(xié)同作用，以期為臨床及相關(guān)基礎研究提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物化學成分和活性成分的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）分別以“白花蛇舌草”為關(guān)鍵詞檢索，獲得該藥物含有的化學成分的信息。考慮到中藥成分紛繁復雜，并非所有成分均能進入體內(nèi)發(fā)揮作用，故選取同時滿足口服利用度（OB）大于30%、類藥性（DL）值大于0.18 2個條件的化學成分作為其活性成分。并通過Pubchem檢索出每一個活性成分的3D結(jié)構(gòu)，以mol2格式保存。

1.2 活性成分作用靶標的獲取 將所有活性分子的3D結(jié)構(gòu)上傳到DRAR-CPI服務器，基于反向分子對接方法，對活性成分和蛋白相互作用的親和性進行打分。按照服務器推薦，選定Z-score＜-0.5的蛋白作為白花蛇舌草活性分子的預測靶標。通過Uniport數(shù)據(jù)庫檢索白花蛇舌草活性分子的預測靶標的PDB ID，限定物種為“human”，從而獲取預測靶標的相應基因。

1.3 肝癌相關(guān)靶標基因的獲取 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞檢索與肝癌相關(guān)的靶標基因。并與白花蛇舌草活性分子的預測靶標基因進行對比，篩選出共同靶標基因，作為白花蛇舌草活性成分抗肝癌的潛在作用靶標。

1.4 成分—作用靶標網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 將白花蛇舌草的活性成分與抗肝癌作用靶標導入Cytoscape軟件，構(gòu)建其成分—作用靶標網(wǎng)絡。

1.5 核心靶標相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析 基于String數(shù)據(jù)庫為背景網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，將白花蛇舌草抗肝癌的潛在靶標導入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“human”，檢索獲得蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存結(jié)果。再將其導入Cytoscape軟件繪制“蛋白相互作用關(guān)系”網(wǎng)絡，然后使用Cytoscape的Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡分析，并根據(jù)連接度（degree）作為指標調(diào)節(jié)節(jié)點的大小、顏色，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。

1.6 分子對接 分子對接技術(shù)（molecular docking）是利用計算機模式識別和優(yōu)化技術(shù)，在三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索能與特定藥物作用靶點在幾何和化學上相匹配的分子，實現(xiàn)計算機輔助藥物篩選（虛擬篩選）。因此，基于上述的蛋白相互作用網(wǎng)絡，篩選出degree值最高的5個靶標，并導入System Dock Web Site服務器與白花蛇舌草活性分子進行對接，并通過對結(jié)果中的Docking Score進行分析，評估白花蛇舌草活性分子與核心靶標之間的結(jié)合潛力。

1.7 生物學過程與通路分析 DAVID數(shù)據(jù)庫為大量的基因或蛋白提供系統(tǒng)全面的生物功能注釋信息，并能找出最顯著富集的生物學注釋。將白花蛇舌草的作用靶標導入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGGK）通路富集分析，得到并保存結(jié)果。選取滿足P＜0.001的通路，并根據(jù)富集基因數(shù)的大小，由大到少排序，選取排名前20的通路，使用OmicShare網(wǎng)站繪圖。

1.8 成分—靶標—通路網(wǎng)絡構(gòu)建 通過對富集基因數(shù)大小排名前20的KEGG通路的分析，結(jié)合相關(guān)文獻檢索，篩選出可能與抗肝癌相關(guān)的通路，找出富集在這些通路上白花蛇舌草抗肝癌的靶點，并與相應藥物的活性分子相配對，構(gòu)建出“成分—靶標—通路”的網(wǎng)絡關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草活性成分分析 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以OB值大于30%、DL值大于0.18為篩選條件，收集白花蛇舌草的活性成分，其中符合條件的活性成分共有15個，如雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等。另外，本研究還選擇了部分OB值低于30%，但含量較高，具有較高藥理研究價值的活性成分，如雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷等。

2.2 潛在靶標預測 在DRAR-CPI服務器中檢索白花蛇舌草活性分子對應的潛在靶標，共獲得829個，去除重復靶標后，共獲得486個潛在靶標。通過與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與肝癌相關(guān)基因的對比，篩選出抗肝癌的可能潛在靶基因73個，主要是腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子147（CD147）、白細胞介素6（IL-6）、染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白1樣基因（CHD1L）、信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等。

2.3 成分—靶標網(wǎng)絡構(gòu)建 分別將白花蛇舌草活性成分和潛在靶標的相關(guān)信息輸入Cytoscape軟件中，構(gòu)建白花蛇舌草的成分—靶標網(wǎng)絡。圖1結(jié)果顯示，圖中含有節(jié)點88個，邊線257條。其中，六邊形節(jié)點代表白花蛇舌草活性成分，圓形節(jié)點代表潛在靶標。邊線代表活性成分與潛在靶標的相互關(guān)聯(lián)。由成分—靶標網(wǎng)絡圖可知，同一活性成分可以作用于不同靶標，同一靶標也可對應不同活性成分，體現(xiàn)出白花蛇舌草治療肝癌具有多成分、多靶標的特點。

圖1 白花蛇舌草“成分—靶標”網(wǎng)絡Figure 1 “Component-target”network of Herba Hedyotis Diffusae

2.4 靶標相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫獲取白花蛇舌草活性分子與肝癌相關(guān)靶標的相互關(guān)系，并將數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，構(gòu)建靶標相互作用網(wǎng)絡。圖2結(jié)果顯示，靶標相互作用網(wǎng)絡中包含節(jié)點73個，邊線311條。其中圓形節(jié)點代表蛋白靶標，邊線代表蛋白靶標之間的相關(guān)性。節(jié)點的面積大小表示蛋白靶標的degree值大小，節(jié)點面積越大，顏色越深，表示其degree值越大。通過比較degree值的大小，并結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測白花蛇舌草抗肝癌與CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3這5個靶基因有關(guān)。

圖2 白花蛇舌草潛在靶標相互作用網(wǎng)絡Figure 2 Interaction network of candidate targets of Herba Hedyotis Diffusae

圖3 Docking Score值柱狀圖Figure 3 Histogram for Docking Score

2.5 分子對接 選取靶標相互作用網(wǎng)絡中degree值最大的5個靶基因名稱——CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3，將其輸入 System Dock Web Site軟件，并與白花蛇舌草15個活性分子進行分子對接。圖3結(jié)果顯示，共有9個（12%）的Docking Score值大于 7，36個（48%）的 Docking Score值在5.0～7.0之間，20個（27%）的 Docking Score值在4.25～5.0之間，10個（13%）的Docking Score值小于4.25。Docking Score值表示分子與靶標之間結(jié)合能力的強弱，一般認為Docking Score值大于4.25表示分子和靶標具有一定的結(jié)合能力，大于5.0表示結(jié)合能力較強，大于7.0表示結(jié)合能力很強。因此，根據(jù)結(jié)果提示，白花蛇舌草的活性成分和靶標之間具有良好的結(jié)合能力。

2.6 GO和KEGG通路富集分析 對白花蛇舌草活性分子的對應靶標進行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，篩選出富集基因數(shù)量較大的通路和生物過程。圖4結(jié)果顯示，細胞成分（CC）分析富集基因數(shù)量較大的有細胞核通路、細胞器膜通路、細胞外區(qū)通路等。圖5結(jié)果顯示，分子功能（MF）分析富集基因數(shù)量較大的有細胞膜通路、細胞核通路、細胞基質(zhì)通路等。圖6結(jié)果顯示，生物進程（BP）分析富集基因數(shù)量較大的有正調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。圖7結(jié)果顯示，由KEGG通路富集分析結(jié)果可知，神經(jīng)降壓素（NTS）信號通路、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白（FoxO）信號通路、類胰島素生長因子（IGF）、絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT信號通路、BCL信號通路、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（EPK）1信號通路等與白花蛇舌草治療肝癌的潛在靶標的相關(guān)性明顯。

圖4 白花蛇舌草活性成分潛在靶標GO通路富集分析的CC分析Figure 4 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on cellular components（CC）analysis

圖5 白花蛇舌草活性成分潛在靶標GO通路富集分析的MF分析Figure 5 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on molecular function（MF）analysis

2.7 “成分—靶標—通路”網(wǎng)絡構(gòu)建 綜合考慮分析GO和KEGG通路富集分析的結(jié)果，篩選出可能具有抗肝癌作用的通路，并將其與白花蛇舌草的活性分子和相應的潛在靶標一一對應，即活性分子與靶標對應，靶標與可能通路對應，從而構(gòu)建出白花蛇舌草治療肝癌的“成分—靶標—通路”網(wǎng)絡，見圖8。其中黃色菱形代表白花蛇舌草的活性成分，紅色圓形代表作用靶點，藍色圓形代表涉及的通路。如圖8顯示，白花蛇舌草治療肝癌涉及雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等活性成分15個，這些活性成分作用的靶標有CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3等5個，這些靶標主要被包含在NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1信號通路中。

3 討論

本研究收集到白花蛇舌草中具有抗肝癌的化學成分主要有雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等。研究表明，雞屎藤次苷、京尼平苷、車葉草苷等可以通過激活TLR-4通路增強巨噬細胞的吞噬功能，從而達到抗炎的功效[6]?，F(xiàn)有化學實驗研究也印證2-羥基-3-甲基蒽醌及苷類有抗腫瘤的活性及作用[7]。

圖6 白花蛇舌草活性成分潛在靶標GO通路富集分析的BP分析Figure 6 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on biological process（BP）analysis

圖7 白花蛇舌草活性成分潛在靶標的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae

圖8 “成分—靶標—通路”網(wǎng)絡關(guān)系圖Figure 8“Component-target-pathways”network

本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草可通過CD147、IL-6、TNF-α、STAT3等靶標作用達到抗肝癌的作用。一系列的研究顯示，CD147在肝癌患者體內(nèi)高表達，可誘導合成大量MMP和血管生成從而促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。馮越等[9]的實驗研究結(jié)果顯示在肝癌患者中TNF-α水平明顯高于正常值，可與化療藥物協(xié)同作用抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。此外，研究顯示STAT3有一定程度的促癌作用，如果特異性敲除小鼠的STAT3基因，肝癌的發(fā)展過程與野生型小鼠有明顯差異。乙型肝炎病毒的X蛋白可以調(diào)控IL-6的表達，當IL-6濃度超過一定的閾值后就可以促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。根據(jù)本研究結(jié)果，推測白花蛇舌草可能通過提高體內(nèi)TNF-α水平或下調(diào)CD147、STAT3、IL-6的表達來發(fā)揮抗肝癌的作用。李秀萍等[11]對肝損傷的小鼠進行實驗后發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草可調(diào)整CD4+T細胞和CD8+T細胞之間的平衡，降低血漿TNF-α和IL-6的水平，減少肝損傷。南錫浩等[12]研究證實白花蛇舌草可通過作用于JAK2/STAT3通路途徑而對T24造成影響。以上報道均與本研究結(jié)果相符合。

本研究結(jié)果顯示，與白花蛇舌草治療肝癌相關(guān)的通路有：NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等。其中，NTS可以促進炎癥因子釋放，形成的炎性微環(huán)境具有促進腫瘤生長的作用[13]。肝癌細胞中FoxO 3a的表達下調(diào)會加速肝癌干細胞的更新過程，而類胰島素生長因子（IGF）對FoxO 3a的表達起反向調(diào)節(jié)的作用[14]。在BCL家族中，BCL-2具有抑制凋亡的作用，BAD可與BCL-2結(jié)合達到促進凋亡的效果。AKT可以促進BAD磷酸化，阻止其與BCL-2結(jié)合達到抑制凋亡的作用。研究顯示，在肝細胞性肝癌組中，BCL-2陽性表達率顯著高于膽管癌和肝硬化組[15，16]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，分析白花蛇舌草在抗肝癌治療方面的有效化學成分和分子機制，結(jié)果顯示白花蛇舌草中具有治療肝癌作用的化學成分可能是雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、京尼平、車葉草苷等。此藥可能通過CD147、IL-6、TNF-α、STAT3、CHD1L等靶標及NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等信號通路起治療作用。通過相關(guān)網(wǎng)絡圖的構(gòu)建可直觀地顯示出白花蛇舌草治療肝癌具有多成分、多途徑等共同作用的特點，符合中醫(yī)藥治療疾病的特點，相比西藥的單基因—單靶點的作用機制，優(yōu)勢明顯。本研究通過分子對接驗證了網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)的可靠性，所得結(jié)果也與現(xiàn)有文獻報道高度符合，但本研究結(jié)果只是一種分子機制上的預測探討，藥物具體作用機制的確認仍需通過進一步驗證。