劉瀟晗， 李奕健， 石志棉， 蘇雨苗， 杜勤

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405）

穿心蓮來(lái)源于爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，以地上部分入藥[1]，又名一見(jiàn)喜、苦膽草、春葉秋蓮等，該藥材性味苦寒，具有清熱解毒、涼血、消腫的功效及抗菌等作用[2]。穿心蓮藥材的臨床需求量大，但其野生資源較少，藥材資源全部來(lái)源于人工種植。目前受環(huán)境氣候、人工栽培等因素的影響，穿心蓮的質(zhì)量產(chǎn)量不斷降低，品種也不斷退化[3]，因此，研究高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的穿心蓮的栽培新方法十分必要。

落地生根來(lái)源于景天科植物落地生根Bryophyllum pinnatum（L.f.）Oken，別名花蝴蝶、倒吊蓮、土三七、葉生根、番鬼牡丹、葉爆芽、天燈籠、槍刀草等[4]。落地生根生命力強(qiáng)，易栽培、適應(yīng)性強(qiáng)，資源豐富，價(jià)廉易得[5，6]。落地生根植株內(nèi)生菌具有固氮、分泌生長(zhǎng)素等促生長(zhǎng)作用[7]。本研究考察落地生根提取液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 穿心蓮種子于2017年10月收集于廣州大學(xué)城，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室杜勤教授鑒定為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的成熟種子；落地生根于2017年12月收集于廣州大學(xué)城，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室杜勤教授鑒定為景天科植物落地生根Bryophyllum pinnatum（L.f.）Oken的全草。

1.2 儀器 GZX-9023MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JJ300電子天平（廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司）；QF-PRX-160智能人工氣候箱（上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司）；755 B紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）；TG6-W微量高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；OK-Y104植物營(yíng)養(yǎng)測(cè)定儀（鄭州歐柯奇儀器制造有限公司）。

1.3 試劑 愈創(chuàng)木酚（C7H8O2）分析純（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：20171021）；過(guò)氧化氫（H2O2）分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130302）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2014081052）；磷酸氫二鉀三水合物（K2HPO4·3H2O）分析純（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2016081002）。

1.4 落地生根莖水提液的制備 精密稱(chēng)取落地生根的莖150 g，剪成約2 cm小段，研碎，加450 mL蒸餾水浸泡60 min，每15 min振蕩1次。雙層紗布過(guò)濾，取濾液（為母液，濃度為100%）備用，分別取20、40、60、80、100 mL上清液定容至100 mL，配成體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%的水提液，用作種子萌發(fā)的效應(yīng)試驗(yàn)。

1.5 穿心蓮種子萌發(fā)試驗(yàn) 參照童家赟等[8，9]的方法，用各濃度的落地生根莖水提液浸泡穿心蓮供試種子24 h后，用蒸餾水沖洗2～3次，均勻放入培養(yǎng)皿（鋪有一層濕紗布和一層濕濾紙），每皿50顆，4次重復(fù)。濾紙每天同一時(shí)間用對(duì)應(yīng)的提取液潤(rùn)濕。以蒸餾水作同樣處理為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于27.5℃的智能人工氣候箱中培養(yǎng)，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，剔除長(zhǎng)霉菌及腐爛的種子，直至種子連續(xù)2 d無(wú)種子萌發(fā)視為萌發(fā)結(jié)束。

1.6 穿心蓮幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 用各濃度的落地生根莖水提液浸泡穿心蓮供試種子24 h后，用蒸餾水沖洗2～3次，均勻放入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿事（鋪有一層濕紗布和一層濕濾紙），每皿50顆，4次重復(fù)。濾紙每天同一時(shí)間用對(duì)應(yīng)的提取液濕潤(rùn)。用蒸餾水作同樣處理為對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于27.5℃的智能人工氣候箱中培養(yǎng)，每天剔除長(zhǎng)霉菌及腐爛的種子。第15天時(shí)，隨機(jī)選取10棵幼苗，用蒸餾水清洗后晾干，記錄鮮質(zhì)量，測(cè)量根長(zhǎng)及莖長(zhǎng)[1]。

1.7 穿心蓮幼苗POD酶活性測(cè)定 根據(jù)“1.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行穿心蓮發(fā)芽試驗(yàn)，第15天時(shí)，稱(chēng)取各組新鮮穿心蓮幼苗0.4 g于研缽中，加入1 mL提取液，研磨成勻漿；再加入9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH6.0），以4 000 r/min離心15 min，收集上清液。取分光光度計(jì)比色皿2只，將4 mL反應(yīng)混合液（0.05 mol/L pH6.0磷酸緩沖液2 mL、酶液1 mL、愈創(chuàng)木酚溶液1 mL）和1 mL體積分?jǐn)?shù)0.3%H2O2加入試管中，立即混勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)下記錄吸光度值。以后每30 s記錄1次，記錄4 min，以緩沖液代替酶液作對(duì)照。各組重復(fù)3次。

1.8 穿心蓮植株生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)“1.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行穿心蓮發(fā)芽試驗(yàn)。第7天將幼苗移植至土壤（經(jīng)各濃度落地生根水提液濕潤(rùn)）。第8天起澆自來(lái)水以保持濕潤(rùn)。第66天時(shí)，隨機(jī)選取6棵植株，用蒸餾水清洗后晾干，記錄全株鮮質(zhì)量、地上部分鮮質(zhì)量及地下部分鮮質(zhì)量，并計(jì)算根冠比，測(cè)量第1對(duì)真葉的葉長(zhǎng)、葉寬、含氮量及葉綠素含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法及公式 試驗(yàn)過(guò)程中保持發(fā)芽床濕潤(rùn)，每天觀察種子萌發(fā)情況，以胚根突破種皮為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，剔除長(zhǎng)霉菌及腐爛的種子，直至連續(xù)2 d無(wú)萌發(fā)種子為止。根據(jù)最適萌發(fā)條件下的發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以達(dá)到50%發(fā)芽率的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子萌發(fā)達(dá)到最高，以后再無(wú)萌發(fā)種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間[10]。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以Duncan法檢驗(yàn)比較不同處理間的差異性（以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。本研究涉及到的公式：發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100%；發(fā)芽勢(shì)（%）=（規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)）×100%；根冠比=地下部分鮮質(zhì)量/地上部分鮮質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 落地生根提取液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響 不同濃度落地生根浸提液處理穿心蓮種子2 d后，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。20%處理組和60%處理組的種子發(fā)芽率與0%對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但60%處理組的發(fā)芽率為82%，顯著高于40%處理組（P＜0.05），可促進(jìn)穿心蓮種子在發(fā)芽周期的前2 d內(nèi)萌發(fā)。80%處理組的發(fā)芽率為90%，比0%對(duì)照組高出的12%（P＜0.05），可促進(jìn)穿心蓮種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率。40%處理組和100%處理組與對(duì)照組相比，均對(duì)穿心蓮種子的發(fā)芽率呈顯著抑制作用。另外，由表1可知，60%處理組可提高發(fā)芽勢(shì)，其他處理組均抑制發(fā)芽勢(shì)。表明濃度為60%～80%處理組的落地生根莖水提液間可促進(jìn)穿心蓮種子萌發(fā)，促進(jìn)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，且效果顯著。

表1 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響Table 1 The effect of the water extract from stem ofHerba Seu Radix Bryophylli Pinnati on seedgermination of Herba Andrographitis（±s，n=4）

表1 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響Table 1 The effect of the water extract from stem ofHerba Seu Radix Bryophylli Pinnati on seedgermination of Herba Andrographitis（±s，n=4）

注：同行數(shù)據(jù)末，不含相同字母者表示經(jīng)Duncan法檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05）

發(fā)芽勢(shì)（p/%）42.2±2.2b 36.0±2.3c 34.1±1.7c 48.0±2.0a 39.0±1.7b 32.0±0.8c落地生根莖水提液濃度（φ/%）0 20 40 60 80 100發(fā)芽率（p/%）78.0±3.7b 77.0±6.0b 68.1±5.9c 82.0±5.0b 90.0±1.6a 67.1±9.1c

圖1 不同濃度落地生根莖水提液處理對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)的影響Figure 1 The effect of different concentrations of water extract of stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on seed germination of Herba Andrographitis

2.2 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)的影響 不同濃度落地生根莖水提液處理穿心蓮種子15 d后，對(duì)其幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2。各個(gè)濃度落地生根莖水提液均可以促進(jìn)生長(zhǎng)15 d的穿心蓮幼苗根、莖及鮮質(zhì)量增加。20%、40%、60%處理組與0%對(duì)照組相比，穿心蓮幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)及鮮質(zhì)量均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；80%處理組和100%處理組穿心蓮幼苗莖長(zhǎng)較0%對(duì)照組分別增加221.43%和203.57%，鮮質(zhì)量較0%對(duì)照組分別增加106.67%和100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明各濃度落地生根莖水提液均可促進(jìn)穿心蓮幼苗根、莖及鮮質(zhì)量的增加，其中濃度為40%的落地生根水提液對(duì)根長(zhǎng)及濃度為80%的落地生根水提液對(duì)莖長(zhǎng)、全株鮮質(zhì)量的效果最明顯。

2.3 落地生根莖提取液對(duì)穿心蓮幼苗POD酶活性的影響 用不同濃度落地生根莖水提液處理穿心蓮幼苗。由圖2可知，濃度在0%～80%時(shí)，幼苗POD酶活性隨落地生根莖水提液濃度的增加而降低；濃度高于80%時(shí)，幼苗POD酶活性則隨落地生根莖水提液的濃度增加而增高，但仍處于抑制狀態(tài)。表明落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗POD酶活性具有抑制作用。

表2 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of the water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on the seedling growth of Herba Andrographitis （±s，n=4）

表2 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of the water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on the seedling growth of Herba Andrographitis （±s，n=4）

注：同列數(shù)據(jù)末，不含相同字母者表示經(jīng)Duncan法檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05）

全株鮮質(zhì)量（m/g）0.075±0.004d 0.105±0.004c 0.100±0.004c 0.135±0.004b 0.155±0.004a 0.150±0.030a落地生根莖水提液濃度（φ/%）0 20 40 60 80 100根長(zhǎng)（l/cm）2.430±0.514c 3.140±0.474a 3.440±0.425a 3.290±0.821a 3.070±0.481ab 2.570±0.638bc莖長(zhǎng)（l/cm）0.560±0.052d 0.930±0.182c 1.530±0.287b 1.580±0.199b 1.800±0.226a 1.700±0.323ab

圖2 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗POD酶活性的影響Figure 2 The effect of water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on the activity of POD of Herba Andrographitis seedlings（±s，n=4）

2.4 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株的影響

2.4.1 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株生長(zhǎng)的影響 用不同濃度的落地生根莖水提液處理穿心蓮植株。由表3、圖3可知，與0%對(duì)照組比較，60%、80%、100%處理組的鮮質(zhì)量分別增加43.48%、18.26%、9.57%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），20%處理組和40%處理組雖抑制植株鮮質(zhì)量的增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各濃度處理組根冠比均比0%對(duì)照組增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中80%、100%處理組的增效作用更明顯，與0%對(duì)照組比較分別增加49.47%、37.37%。

2.4.2 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株葉的影響 由表3可知，與0%對(duì)照組比較，40%處理組的葉綠素顯著增加14.15%，含氮量增加11.54%（P＜0.05），其他處理組葉綠素含量及含氮量均無(wú)顯著性差異。由圖4可知，經(jīng)落地生根莖水提液處理后，穿心蓮葉長(zhǎng)及葉寬均增加。其中40%處理組穿心蓮葉長(zhǎng)、葉寬增加顯著，分別增加13.07%、21.95%?？梢?jiàn)40%落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株葉長(zhǎng)、葉寬生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯。

表3 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株生長(zhǎng)的影響Table 3 The effects of water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on plant growth of Herba Andrographitis （±s，n=4）

表3 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株生長(zhǎng)的影響Table 3 The effects of water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on plant growth of Herba Andrographitis （±s，n=4）

注：同列數(shù)據(jù)末，不含相同字母者表示經(jīng)Duncan法檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05）

落地生根莖水提液濃度（φ/%）葉含氮量（w/%）1.560±0.042bc 1.540±0.134c 1.740±0.134a 1.700±0.071ab 1.560±0.089bc 1.540±0.114c 0 20 40 60 80 100全株鮮質(zhì)量（m/g）0.115±0.004d 0.108±0.002e 0.111±0.003de 0.165±0.004a 0.136±0.001b 0.126±0.201c根冠比（p）0.281±0.001f 0.373±0.004c 0.321±0.006d 0.303±0.081e 0.420±0.007a 0.386±0.127b葉綠素含量[w/（mg·g-1）]14.280±0.536b 14.060±1.692b 16.300±1.500a 15.860±0.879ab 14.360±1.222b 14.040±1.553b

圖3 不同濃度落地生根莖水提液處理對(duì)穿心蓮植株生長(zhǎng)的影響Figure 3 The effect of different concentrations of water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on the growth of Herba Andrographitis plant

圖4 落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮植株葉生長(zhǎng)的影響Figure 4 The effect of the water extract from stem of Herba Seu Radix Bryophylli Pinnati on the growth of Herba Andrographitis leaves（±s，n=4）

3 討論

本研究重點(diǎn)考察落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響。采用不同濃度落地生根莖水提液的方法對(duì)穿心蓮種子進(jìn)行處理，測(cè)定穿心蓮種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和POD酶活性等指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，穿心蓮種子萌發(fā)時(shí)，隨落地生根莖水提液濃度的遞增，20%和40%濃度的落地生根莖水提液處理穿心蓮種子，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均略有降低。60%濃度的落地生根莖水提液處理穿心蓮種子，可提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。80%濃度顯著提高了種子發(fā)芽率，但發(fā)芽勢(shì)降低。100%落地生根莖水提液處理后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均降低，對(duì)種子萌發(fā)呈抑制作用。由此可見(jiàn)，促進(jìn)種子萌發(fā)的最適濃度在60%～80%之間。

穿心蓮幼苗生長(zhǎng)時(shí)，各個(gè)濃度的落地生根莖水提液均可促進(jìn)穿心蓮根、莖的生長(zhǎng)及增加鮮質(zhì)量。40%的落地生根莖水提液對(duì)根的促進(jìn)作用最為明顯，濃度為80%的落地生根莖水提液對(duì)莖和鮮質(zhì)量的促進(jìn)作用最明顯。由于穿心蓮的有效成分主要在莖葉中，故濃度80%的落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)。

POD酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中活性會(huì)不斷發(fā)生變化。POD酶參與了木質(zhì)素的合成，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，因此POD酶可作為評(píng)價(jià)組織老化的一種生理指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各濃度的落地生根莖水提液均能抑制穿心蓮幼苗內(nèi)POD酶的活性。故落地生根莖水提液抑制了穿心蓮幼苗中POD酶的活性，從而可以減緩穿心蓮的衰老，促進(jìn)穿心蓮的生長(zhǎng)。

由于穿心蓮的入藥部位為干燥地上部分，因此在穿心蓮植株生長(zhǎng)時(shí)，宜添加濃度40%的落地生根莖水提液，以促進(jìn)植株葉片的面積、葉綠素含量、氮含量的增加。

綜上所述，在一定濃度范圍內(nèi)，落地生根莖水提液對(duì)穿心蓮種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。