余雙英 劉璐 張軍東

摘 要 建立氣相色譜法測定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測定方法，并進行方法學驗證。該方法以正己烷為萃取劑，采用了聚乙二醇毛細管柱Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1 mm）、氫火焰離子化檢測器（FID）進行檢測。方法學驗證結(jié)果顯示，該方法專屬性良好，線性范圍為0.034 1～0.102 4 mg/ml；中間精密度所得相對標準偏差RSD僅為1.09%（n=12）；以80%、100%、120%濃度水平測定的平均回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組準確度溶液測得回收率的總平均值為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9）。該方法專屬性較強，精密度、準確度、穩(wěn)定性良好，可作為S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯的含量測定方法。

關(guān)鍵詞 氣相色譜 豬血漿 磷酸三丁酯 含量測定

中圖分類號：R927.11； R982 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0065-03

Determination of the tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma by gas chromatography

YU Shuangying*， LIU Lu， ZHANG Jundong**

（ Shanghai Haohai Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT A gas chromatography method for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma was established. Gas chromatography was performed using n-hexane as an extractant by a hydrogen flame ionization detector （FID） on an Agilent DB-WAX column （30 m×0.53 mm×1 mm）. The results of methodological verification showed that the method had good specificity with a linearity over the range of 0.034 1-0.102 4 mg/ml. The relative standard deviation （RSD） obtained from the intermediate precision was only 1.09% （n=12）. The average recovery rates from three samples at different concentrations （80%， 100%， 120%） were 99.38%， 95.66%， 99.13%， respectively. The total recovery rate was 98.06% （n=9） with RSD 2.72% （n=9）. This method has good specificity， precision， accuracy and stability and can be used for the determination of tributyl phosphate in S/D inactivated pig plasma.

KEy WORDS gas chromatography； pig plasma； tributyl phosphate； content determination

豬源纖維蛋白黏合劑主要是由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應的溶解液組成的一種復合制劑，臨床常用于術(shù)中輔助止血[1]，生物相容性好、無毒無刺激，能有效黏附于創(chuàng)口起到良好的止血和促進創(chuàng)口愈合的作用[2-6]。為提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低該類產(chǎn)品傳播動物病毒的風險，本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導原則》中“有機溶劑/去污劑（S/D）處理法”[1，7]對豬血漿進行病毒滅活，其中所用的有機溶劑為磷酸三丁酯。因此，在實際生產(chǎn)工藝中，為保證病毒滅活效果，提高終產(chǎn)品的臨床使用安全性，磷酸三丁酯的質(zhì)量控制十分重要。

本方法主要參考中國藥典2015年版四部磷酸三丁酯殘留量測定法[8]，并適當進行了改進。其測定原理為：利用高氯酸將血漿中的蛋白進行沉淀，用正己烷萃取溶液中的磷酸三丁酯和磷酸三丙酯，離心，取上層清液，利用配置氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀測定磷酸三丁酯含量。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬血漿（公司自產(chǎn)，批號：20170207、20170209、20170210）；磷酸三丁酯和磷酸三丙酯（對照品，美國Sigma-Aldrich公司）；高氯酸和磷酸三丁酯（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；正己烷（HPLC級，海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司）；聚山梨酯-80（藥用級，湖南華日制藥有限公司）。

1.2 儀器

7890B氣相色譜儀（美國Agilent公司）；ME104分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（Scientific Industries公司）；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)公司）。

1.3 色譜條件

Agilent DB-WAX聚乙二醇毛細管柱（30 m×0.53 mm×1 mm）；進樣口溫度190 ℃，無分流模式；進樣量1 ml；FID檢測器溫度210 ℃，空氣400 ml/min，氫氣40 ml/min，氮氣25 ml/min；于160 ℃運行15 min。

1.4 溶液及樣品配制

內(nèi)標儲備液（400 mg/ml）：精密稱重磷酸三丙酯對照品40 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液：精密稱重磷酸三丁酯對照品60 mg，置100 ml量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，混勻，即為對照品儲備液（600 mg/ml）。精密量取0.5 ml對照品儲備液、0.5 ml內(nèi)標儲備液和3.5 ml正己烷，混勻，即得（STD溶液）。

樣品溶液：稱取一定質(zhì)量的血漿于燒杯中，加入血漿質(zhì)量比3%的聚山梨酯80，攪拌至完全溶解，再加入血漿質(zhì)量比3%的磷酸三丁酯，混勻后，取6 ml于100 ml容量瓶中，用純化水定容，作為樣品儲備液（S/D滅活血漿）。準確量取0.5 ml樣品儲備液和0.1 ml高氯酸溶液（1.5 mol/L）于10 ml離心管中，振蕩混勻，于37℃水浴10 min，冷卻至室溫，再加入0.5 ml內(nèi)標儲備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，吸取上層清液進樣分析。

空白基質(zhì)：同上配制不含磷酸三丁酯的空白基質(zhì)溶液。

1.5 方法學驗證

1.5.1 專屬性

分別取按照1.4項下方法制備的對照品溶液（STD溶液）、空白基質(zhì)和正己烷（空白溶液）適量于進樣瓶中，按照1.3項下色譜條件進樣分析?？瞻兹芤?、空白基質(zhì)和對照品溶液色譜圖見圖1。

1.5.2 線性

精密量取對照品儲備液（600 mg/ml）0.75、0.60、0.5、0.4和0.25 ml于離心管中，再分別加入內(nèi)標儲備液（400 mg/ml）0.5 ml和相應體積的正己烷，使得各線性溶液總體積均為4.5 ml，混勻后，按照1.3項下色譜條件各進樣1次。以各磷酸三丁酯對照品峰面積與內(nèi)標峰面積比，對磷酸三丁酯對照品濃度作線性回歸，求得直線回歸方程。

1.5.3 準確度

取9支10 ml離心管，每3支為一組，分別加入0.25 ml樣品儲備液，再分別加入0.20 ml、0.25 ml、0.30 ml對照品儲備液，再各加入0.1 ml高氯酸溶液，振蕩混勻，置于37 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入0.5 ml內(nèi)標儲備液和4 ml正己烷，混勻后，3 000 r/min離心20 min，取上層清液，按照1.3項下色譜條進樣分析，分別命名為R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3、R120%-1～R120%-3。

1.5.4 精密度（重復性/中間精密度）

在不同的日期，由兩位研究員分別按照1.4項下的樣品制備方法平行制備6份樣品溶液，并按照1.3項下色譜條件進樣分析，比較兩位研究員測定結(jié)果，并計算12組結(jié)果的RSD。

1.5.5 溶液穩(wěn)定性

取樣品溶液和對照品溶液（STD溶液），放置在室溫條件下，以預定的時間間隔進樣分析，計算溶液在不同時間點和0時間點磷酸三丁酯含量的比值。

1.5.6 耐用性

固定其他色譜條件或樣品處理方法不變，實驗方法發(fā)生微小變動，如調(diào)整離心轉(zhuǎn)速為（3 000±500）r/min、調(diào)整柱溫為（160±2）℃、選用兩種不同批次的色譜柱、調(diào)整載氣流速為（8.0±0.2）ml/min，考察其耐用性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

空白溶液和空白基質(zhì)在磷酸三丁酯峰的保留時間（約11.3 min）處均沒有干擾，內(nèi)標物均出峰正常（約4.9 min），說明該方法專屬性良好（見圖1）。

2.2 線性

線性方程為y=25.829 3x-0.063 8，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，滿足接受標準（r≥0.990）。

2.3 準確度

3組不同濃度樣品的回收率分別為99.38%、95.66%、99.13%，9組樣品的總平均回收率為98.06%（n=9），RSD為2.72%（n=9），滿足接受標準（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重復性/中間精密度）

兩位實驗員測得12份樣品中磷酸三丁酯含量的平均值為10.41 mg/ml，RSD為1.09%（n=12），結(jié)果滿足接受標準（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 溶液穩(wěn)定性

對照品和樣品溶液于室溫放置48 h后，在各相應穩(wěn)定性時間點磷酸三丁酯含量與0時間點測得含量的比值均在95.0%～105.0%之間，說明樣品和對照品穩(wěn)定性良好（表3）。

2.6 耐用性

各參數(shù)微調(diào)后測得結(jié)果與正常條件下測得磷酸三丁酯含量的比值均在95.0%～105.0%，滿足接受標準（95.0%～105.0%），說明該方法耐用性良好（表4）。

2.7 樣品檢測

取3批豬血漿（批號：20170207、20170209、20170210），按照1.4項下樣品制備方法進行處理，并按照1.3項下色譜條件進樣分析，測定磷酸三丁酯含量分別為10.41、10.38和10.45 mg/ml。

3 討論

與藥典[8]和文獻方法[9-10]相比，本方法在樣品處理時增加了正己烷與供試品的體積比，可以提高磷酸三丁酯和磷酸三丙酯的萃取效率，并增大了離心轉(zhuǎn)速，可以使蛋白快速沉淀；數(shù)據(jù)處理方式上，藥典方法采用線性方程計算，本方法采用單點法計算，縮短了分析測定時間，從而可以提高工作效率。該方法專屬性強，準確度、精密度較好，可以用于測定S/D滅活豬血漿中磷酸三丁酯含量。

參考文獻

[1] 劉璐， 趙瑩瑩， 張軍東. 氣相色譜法測定豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留量[J]. 上海醫(yī)藥， 2017， 38（21）： 76-80.

[2] 孟志云， 竇桂芳， 卜鳳榮. 纖維蛋白粘合劑的研究進展[J].中國輸血雜志， 2002， 15（2）： 143-145.

[3] 張麗鈴， 何淑琴， 鄧志華. 纖維蛋白膠的臨床應用進展[J].實用醫(yī)藥雜志， 2014， 31（5）： 451-452.

[4] 劉兆路. 人纖維蛋白粘合劑對家兔的刺激性和對創(chuàng)口愈合的促進作用[D]. 濟南： 山東農(nóng)業(yè)大學， 2017.

[5] 褚永新， 陸清聲， 張雷， 等. 纖維蛋白粘合劑配合無造影劑腔內(nèi)隔絕術(shù)治療腹主動脈瘤短期療效分析[J]. 臨床外科雜志， 2018， 26（2）： 117-120.

[6] 陳安清， 王哲， 王春生， 等. 凍干人纖維蛋白膠在心血管外科手術(shù)中的應用[J]. 藥物與臨床， 2005， 23（6）： 348-350.

[7] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 關(guān)于印發(fā)《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導原則》的通知[EB/OL].（2002-05-09） [2017-06-03]. http：//www.sda.gov.cn/WS01/ CL0058/9330.html.

[8] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2015年版）四部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 通則3205.

[9] 劉婷婷， 徐琛， 陳益樂， 等. 氣相色譜法測定醫(yī)用纖維蛋白膠制品中磷酸三丁酯殘留量[J]. 中國臨床藥學雜志， 2011， 20（4）： 225-228.

[10] 王偉， 陳智巖. 氣相色譜法測定凍干纖維蛋白膠制品中磷酸三丁酯殘留量[J]. 黑龍江中醫(yī)藥， 2009， 38（3）： 46-47.