任曉鳳 許亞軍

黃河三門(mén)峽醫(yī)院 河南科技大學(xué)附屬黃河醫(yī)院，河南省三門(mén)峽市 472000

肝癌發(fā)病率在國(guó)內(nèi)居高不下。前人基礎(chǔ)研究多集中在藥物肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和凋亡率的影響，但是未對(duì)凋亡相關(guān)蛋白做深入研究。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿(Berberine，Ber)對(duì)數(shù)種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，例如人肝癌細(xì)胞HepG2和人胃癌細(xì)胞BGC-803等[1-2]。本文擬研究Ber對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖及凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax表達(dá)的影響，探討B(tài)er的抗腫瘤應(yīng)用，為臨床提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。胎牛血清購(gòu)自蘭州榮曄生物科技有限公司。Ber購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。CCK8購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Bcl-2抗體、bax抗體和β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物干預(yù) 將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2、無(wú)菌、恒溫、恒濕培養(yǎng)，取3-4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。藥物干預(yù)確定分組：對(duì)照組為RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組加入Ber使終濃度分別達(dá)到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L。分別培養(yǎng)24h、48h和72h。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 SMMC-7721細(xì)胞用0.25%胰酶消化后均勻接種在96孔板內(nèi)，貼壁后加入Ber使終濃度達(dá)到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，每種濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作24h、48h、72h后，每孔加入CCK8溶液10μl再無(wú)菌培養(yǎng)1.5h，490nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度值，計(jì)算各組增殖抑制率。

1.4 Western blot檢測(cè)bcl-2和bax蛋白的表達(dá) 選取對(duì)數(shù)期SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板，長(zhǎng)滿(mǎn)80%后加入Ber使終濃度達(dá)到0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48h，RIPA裂解液裂解，BCA法蛋白定量，12%SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印后使用5%脫脂奶粉室溫封閉3h，加入小鼠源bcl-2抗體(1∶200)、bax抗體(1∶200)和β-actin抗體(1∶200)4℃孵育過(guò)夜，1×TBST洗膜3次，加入含HRP的抗小鼠二抗室溫孵育3h，再次用1×TBST洗膜3次，采用BIO-RAD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，Image Lab軟件分析條帶。

2 結(jié)果

2.1 Ber抑制SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng) 經(jīng)Ber處理過(guò)的SMMC-7721細(xì)胞出現(xiàn)縮小、皺縮現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著B(niǎo)er濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)被Ber逐漸抑制，有一定的濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，同時(shí)在0.2mmol/L濃度和48h時(shí)間點(diǎn)條件下，抑制率最高(見(jiàn)表1)。提示Ber可在體外抑制SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)。增殖抑制率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

表1 Ber對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

注：a指與Ber 0.1mmol/L組相比，P<0.05；b指與Ber 0.2mmol/L組相比，P<0.05；*指與24h相同濃度組相比，P<0.05；#指與48h相同濃度組相比，P<0.05。

2.2 Ber上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞bax表達(dá)，下調(diào)bcl-2表達(dá)，促進(jìn)凋亡 選取48h條件下Ber最適濃度0.2mmol/L干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞，做Western blot發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組bax蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.001)，bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P=0.026<0.05)，bax/bcl-2比值明顯增高(P<0.001)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明Ber可以通過(guò)上調(diào)bax蛋白表達(dá)、bax/bcl-2比值和下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)，從而介導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖1)。

圖1小檗堿對(duì)SMMC-7721細(xì)胞bcl-2及bax蛋白表達(dá)的影響

注：a指與對(duì)照組相比，P<0.05。

3 討論

肝癌發(fā)病率高，病死率也高。目前藥物治療多管齊下，使患者生存時(shí)間延長(zhǎng)。考慮到中草藥為我國(guó)獨(dú)有，尤其小檗堿源自黃連，為一種季銨生物堿，取材與獲取方便，以往研究發(fā)現(xiàn)該藥具有多種作用，除具有明確抗炎作用外[3]，近年來(lái)研究較多的是抗腫瘤作用，研究證實(shí)其對(duì)肝癌、胃癌、乳腺癌等均具有抑制作用[4-8]，也有少數(shù)學(xué)者研究證實(shí)小檗堿對(duì)高血壓導(dǎo)致心室重塑[9]、糖尿病[10-11]、精神分裂癥[12]等亦有效。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，Ber對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721有顯著的抑制作用，這種抑制作用可能與上調(diào)bax蛋白、bax/bcl-2比值及下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。通過(guò)采用不同時(shí)間、不同濃度Ber作用于體外培養(yǎng)的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Ber可以在體外抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，特別是在48h最為明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ber通過(guò)高表達(dá)bax、低表達(dá)bcl-2來(lái)介導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡，從而證實(shí)了與文獻(xiàn)中Ber對(duì)肝癌細(xì)胞等有抑制作用類(lèi)似[1,4]。然而，Ber通過(guò)何傳導(dǎo)通路來(lái)抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721，需要進(jìn)一步研究。