黃 震 武紅梅△ 吳雨梅 李 娜 謝振東 陳思達 方宏才

1 廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116； 2 深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院； 3 江西省九江學院附屬醫(yī)院

結核桿菌通常是侵襲肺部引起肺結核。結核桿菌是結核病的病原體，它是一種無處不在并且侵襲性超強的人類病原菌。據(jù)估計，全世界1/3的人口感染了結核病，并且每年與結核病相關的死亡有數(shù)百萬[1]。作為一種脂聚糖，ManLAM是結核桿菌細胞壁的主要成分并且也是結核桿菌的主要毒力因子[2]。一直認為它對宿主免疫力具有刺激和抑制作用。它能夠抑制巨噬細胞中吞噬體—溶酶體融合、樹突細胞成熟以及CD4+T細胞激活和招募。至于細胞因子產物的影響，樹突細胞中ManLAM使IL-10產物增加，同時抑制了IL-12的產生[3]。

作為IL-1家族的一個新成員，IL-37最近被證實在自身免疫性疾病、腫瘤的先天免疫及炎癥反應中是一個天然抑制因素，并且通過誘導調節(jié)性T細胞以及削弱效應T細胞反應活性，它在調節(jié)適應性免疫上也起著重要的作用[4]。重要的是，在細菌性疾病中，IL-37是天然免疫反應對抗感染介導的炎癥的一個廣譜抑制劑，因而被認為是減少肺部損傷的治療劑[5]。

已經證實了IL-37主要在上皮細胞中表達，并且能夠被一些TLR配體誘導表達，例如 TLR2和TLR4[6]。此外，細胞內信號級聯(lián)分析表明， ERK1/2(細胞外信號調節(jié)激酶1/2)和p38抑制劑能夠抑制IL-37的表達。作為另一個重要的抑制性細胞因子，樹突狀細胞中TLRs刺激以及MAPK家族成員(ERK1/2和p38)的激活也能誘導IL-10的表達增加[7]。結核桿菌表面最主要的脂聚糖——ManLAM(甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖)，是結核桿菌的一個免疫抑制表位。IL-37(白細胞介素-37)是一個最新被鑒定的抗炎因子，它能減弱全身及身體局部的炎癥。然而，ManLAM和IL-37之間的關系仍不清楚。因此，本次研究中，筆者使用A549細胞系來探究ManLAM對人Ⅱ型肺泡上皮細胞中IL-37產生的作用以及相關分子機制。

在本研究中，筆者評估了從結核桿菌中純化的ManLAM是否能夠誘導人Ⅱ型肺泡上皮細胞(即A549細胞)中IL-37的表達，并且檢測了與IL-37的表達有關的分子通路。結果表明ManLAM誘導IL-37的產生具有時間和劑量依賴性，更重要的是，這種影響取決于TLR2表達上升以及p38和ERK1/2 磷酸化增加。

1 材料和方法

1.1 細胞系和細菌 人Ⅱ型肺泡上皮細胞系A549細胞(生物化學和細胞生物學研究所, 中國)，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone, USA)中37℃培養(yǎng)。H37RV結核桿菌購自北京生物制品研究所，在Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且在生長對數(shù)期收集細菌。細菌在使用前用含有0.05% Tween-80的PBS清洗并且均勻破碎。

1.2 ManLAM提取和分析 從H37RV結核桿菌中提取并純化ManLAM，將純化的ManLAM用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染分析。

1.3 RT-PCR(實時定量PCR) 根據(jù)廠家說明書，使用TRIzol法提取A549細胞中的總RNA。用逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。使用特殊的引物和實時定量PCR系統(tǒng)對cDNA進行定量分析。IL-37基因通過以下引物進行擴增放大，上游引物：5’- CAGCCTCTGCGGAGAAAGGAAGT-3’，下游引物：5’- GTTTCTCCTTCTTCAGCTGAAGGGATGGAT-3’；β-actin作為內參對照，上游引物：5’-TCGTCGACAACGGCTCCGGCATGT-3’，下游引物：5’-CATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’。

1.4 Western Blot(蛋白質印跡法) 使用單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology)對IL-37進行檢測。使用MAPK抗體試劑盒(Cell Signaling Technology)通過蛋白質免疫印跡法(Western Blot)對磷酸化的和總的p38和ERK1/2 MAPKs進行檢測。將β-actin設置為內參。條帶用 Fluor S-MultiImager MAX 系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)進行觀察并且通過圖像分析軟件(Quantity One, Bio-Rad Laboratories)進行定量。

1.5 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗) 按照廠家說明書，利用ELISA法測量IL-37水平。人IL-37 ELISA試劑盒購自華美生物(武漢，中國)，所有的樣品均檢測3次。

1.6 siRNA(小干擾RNA)轉染 針對TLR2或TLR4的siRNA或者抑制性siRNA，從生命科技公司獲得。每5×105個A549細胞轉染60pmol siRNA，同時加入3ml脂質體2000到無血清改良的 Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，漂洗干凈，然后將其放入含10%胎牛血清的新鮮RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.7 Flow cytometry(流式細胞儀) 為了減少非特異性結核，所有的染色反應都在4℃進行，細胞首先暴露于Fc受體的單克隆抗體中(Human TruStain FcXTM,Biolegend) 。PE標記的抗TLR2和APC標記的抗TLR4抗體都購自Biolegend公司。細胞通過一個BD Accuri C6流式細胞儀進行分析。

2 結果

2.1 結核桿菌刺激使A549細胞中IL-37表達增加 滅活的H37Rv結核桿菌以10∶1(細菌∶細胞)的比例加入，刺激人Ⅱ型肺泡上皮細胞系A549細胞，在不同的時間段檢測IL-37 mRNA和蛋白表達情況。如圖1A所示，RT-PCR 結果表明：在H37Rv刺激12h后，A549細胞中IL-37 mRNA的表達水平顯著增加(大約增加了7.6倍)。此外，蛋白含量分析也表明H37Rv促進IL-37的產生具有時間依賴性，見圖1B和圖3A。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-37作為一種抑制性細胞因子，在Ⅱ型肺泡上皮細胞對抗結核桿菌感染的反應上可能有一定的作用。

圖1 A549細胞中，滅活的H37RV對IL-37表達的影響分析

A.不同時間段滅活的H37RV誘導IL-37mRNA表達的RT-PCR結果；B.不同時間段滅活的H37RV誘導IL-37蛋白表達的ELISA分析結果；C.從H37RV中分離的水相和氯仿—甲醇相誘導IL-37mRNA表達的RT-PCR結果；D.從H37RV中分離的水相和氯仿—甲醇相誘導IL-37mRNA表達蛋白表達的ELISA分析結果。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

2.2 H37Rv細胞壁成分ManLAM是H37Rv誘導IL-37表達的主要原因 接下來，筆者利用親脂性的和親水性溶劑分離H37Rv成分，例如氯仿:甲醇和水,每種提取物中IL-37表達活性ELISA法進行評估。筆者發(fā)現(xiàn)只有水相顯示對IL-37表達有刺激活性，見圖1C和圖1D，并且與全細菌刺激沒有顯著性差異，與氯仿:甲醇相中的僅僅顯示IL-37表達的微量增加形成了鮮明的對比。這些結果表明：結核桿菌親水性成分是引起IL-37表達的原因。

在結核桿菌親水性成分中，ManLAM是其中最豐富的親水性脂多糖，因此，筆者進一步評估了ManLAM誘導A549細胞中IL-37表達的能力。正如圖2A所示，ManLAM使IL-37 mRNA水平呈劑量依賴性增加，并且在ManLAM以10μg/ml刺激12h時，IL-37表達量增加最大(約7.1倍)。更重要的是，數(shù)據(jù)顯示ManLAM誘導IL-37蛋白產生具有時間和劑量依賴性，見圖2B和圖2C，并且與H37Rv刺激沒有明顯的不同，見圖3A。這些發(fā)現(xiàn)表明：ManLAM是H37Rv能夠誘導人Ⅱ型肺泡上皮細胞產生IL-37的主要成分。

圖2 A549細胞中，從H37RV中提取的ManLAM對IL-37表達影響的分析

A.不同濃度的ManLAM在不同時間段誘導IL-37 mRNA表達的RT-PCR結果； B.同一濃度的ManLAM在不同時間段誘導IL-37蛋白表達的ELISA檢測結果；C.不同濃度的ManLAM同一時間段誘導IL-37蛋白表達的ELISA檢測結果。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

2.3 p38和ERK1/2的激活與ManLAM誘導IL-37產生有關 為了更進一步理解ManLAM誘導IL-37表達的機制，對多個重要信號蛋白抑制劑靶標進行研究，例如JNK或MAPK通路。A549細胞先用各種抑制劑處理30min,然后將這些被處理的細胞用ManLAM刺激24h。結果表明：p38和ERK1/2抑制劑使ManLAM誘導產生的IL-37的量顯著減少，見圖3B，而且，ManLAM大大促進了A549細胞中p38和ERK1/2 MAPKs的磷酸化。這些結果表明 p38 MAPK 和ERK1/2通路可能與ManLAM-誘導的IL-37表達上升有關。

2.4 TLR2與ManLAM誘導IL-37產生有關 TLR配體脂多糖和Pam3CSK4在誘導IL-37產生上是非常有效的[8]，值得注意的是ManLAM也是一種TLRs配體。在A549細胞中，ManLAM刺激大大促使了TLR2和TLR4的表達，更重要的是，敲除TLR2使其不表達后，ManLAM幾乎不能誘導產生的IL-37，同時也幾乎沒有p38和ERK1/2的磷酸化。然而，敲除TLR4，對ManLAM誘導產生IL-37幾乎沒有影響，見圖3C與圖4。因此，TLR2缺陷導致了IL-37產物下降大概是由于它下游信號蛋白p38和ERK1/2激活的下調。這些結果共同表明：ManLAM主要通過調節(jié)TLR2表達和p38和ERK1/2磷酸化來提高人Ⅱ型肺泡上皮細胞中IL-37的產量。

圖3與ManLAM誘導IL-37表達有關的p38 MAPK和ERK1/2的變化

A.A549細胞中，medium (CM)、iH37Rv及 ManLAM誘導24h后，western檢測IL-37表達；B.ELISA檢測培養(yǎng)24h后，各種信號蛋白對A549細胞中ManLAM誘導IL-37產生的影響；C.ManLAM刺激后不同時間段，Westernblot 分析A549細胞中ERK1/2、p38和β-actin的激活情況。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

圖4 A549細胞中，與ManLAM誘導IL-37產生有關的TLR2

A.流式細胞儀分析ManLAM刺激24h后，A549細胞中TLR2及TLR4的表達，在ManLAM刺激之前，用TLR2和TLR4相應的特異性siRNA干擾A549細胞中TLR2和TLR4的表達； B.ELISA檢測A549細胞經與A相同的處理后，上清液中的IL-37的表達；C.有無TLR2 siRNA存在的條件下，Westernblot檢測ManLAM刺激A549細胞后，ERK1/2、p38和β-actin的激活情況。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

3 討論

筆者通過研究，首先證明了結核桿菌的一個毒力因子——ManLAM能夠誘導人Ⅱ型肺泡上皮細胞中IL-37的表達。這種活性主要是由TLR2表達以及p38和ERK1/2的磷酸化來完成。自從第一次描述IL-37以來，IL-37作為先天性免疫的一種基本抑制劑，已經在炎癥和自身免疫性疾病及腫瘤中檢測到了它的mRNA和蛋白質，例如風濕性關節(jié)炎、過敏性皮膚炎、炎癥性腸病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[9]?，F(xiàn)今，IL-37在適應性免疫和霉菌感染上的抑制活性已經擴大了，特別是IL-37在侵襲性曲霉病感染中能減弱肺部損傷。

在結核桿菌感染中，結核桿菌主要聚集在肺部而引起病理損傷。最近，肺泡上皮細胞被證明是對抗呼吸道病原體免疫反應的重要介質。很多體外研究已經證實Ⅱ型肺泡壁細胞能夠使結核桿菌進入細胞，并且，細菌一旦進入Ⅱ型肺泡細胞就能不斷的復制增殖[10]。因此，筆者推測結核桿菌可能通過促進肺泡細胞中IL-37的產生來促進其復制增殖。

在不同時間段，用滅活的結核桿菌株H37Rv刺激人Ⅱ型肺泡上皮細胞系A549細胞。從那些結果中，筆者發(fā)現(xiàn)H37Rv確實促進了IL-37 mRNA表達以及蛋白質產生。由于是第一次報道結核桿菌有誘導IL-37產生的能力，筆者想進一步確定是哪種成分導致了H37Rv誘導產生 IL-37。

H37Rv細菌通過親水性和親脂性試劑將其分為兩部分，例如氯仿:甲醇和水，筆者發(fā)現(xiàn)只有水相對IL-37的產生有明顯的刺激活性。脂多糖已經被報道能誘導A549細胞中IL-37的產生，盡管分枝桿菌沒有脂多糖，但結核桿菌細胞表面包含著名叫ManLAM的復雜脂質糖蛋白，它與脂多糖有很多相同的物理化學特性。在分枝桿菌親水成分中，ManLAM是最豐富的親水性脂聚糖，已經證實它能抑制宿主免疫系統(tǒng)的一個關鍵原因是免疫抑制性細胞因子IL-10的產生。

在A549細胞中，ManLAM誘導IL-37 mRNA和蛋白表達具有時間和劑量依賴性。因此，盡管IL-37產物在ManLAM處理過的 A549 細胞中略低，但是H37Rv和ManLAM刺激孵育24h后，IL-37產物沒有明顯的差別，這種細微的下降可能是由于H37Rv其他的抑制性成分，像mAGP和LprG[11]，這些需要進一步的證實。IL-37抑制了自身免疫性疾病和霉菌感染中促炎因子的產生，像IL-1β、IL-6和TNF,而且ManLAM 或 H37Rv誘導 IL-37產生在各種促炎因子中的作用將會在進一步的研究中加以證實。

MAPK信號通路是炎癥中的一個主要信號通路。在THP1細胞中，由于IL-37的產生，p38和ERK1/2抑制劑能夠抑制MAPK信號通路 。ManLAM不僅能夠激活p38 MAPK 和 MEK/ERK磷酸化以阻止結核桿菌吞噬體成熟，而且能抑制促炎因子的產生，像 IL-8，同時刺激IL-10的產生[12]。筆者實驗結果表明ManLAM促進了A549細胞中p38和ERK1/2磷酸化，并且這兩種蛋白質特異性抑制劑抑制了ManLAM誘導IL-37的產生。然而，JNK抑制劑SP600125也能抑制IL-37產生，至于ManLAM誘導IL-37產生升高的機制還需要進一步的詳細研究。

ManLAM能夠被TLR2和TLR4識別[13]，已經發(fā)現(xiàn)其介導了IL-37的產生。此外，TLR配體也能通過 p38和ERK1/2 MAPK通路促進樹突狀細胞中IL-10的產生[14]。ManLAM刺激24h后,A549細胞表面的TLR2和TLR4表達都顯著增加了，然而只有TLR2敲除能夠減弱ManLAM誘導IL-37產生的能力。更重要的是，ManLAM刺激后，TLR2干擾也能顯著減弱p38和ERK1/2 磷酸化。

綜上所述，本研究首次證實了結核桿菌細胞壁的主要成分ManLAM能夠誘導人Ⅱ型肺泡細胞產生IL-37，它通過使TLR2表達上調，ERK1/2和p38 MAPK磷酸化來介導。這些發(fā)現(xiàn)已經揭示結核桿菌表面ManLAM之前未被認可的免疫調節(jié)作用。