薛愛芹 張爭輝 李銀生

1 菏澤醫(yī)學專科學校，山東省菏澤市 274000； 2 河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學院

肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)主要表現(xiàn)為肺實質(zhì)漸進性不可逆性纖維化進展，同時伴有肺功能降低，表現(xiàn)為干咳、進行性呼吸困難，發(fā)病率和死亡率逐年增加，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，被稱為一種“類腫瘤疾病”，博萊霉素現(xiàn)已用作研究PF的經(jīng)典模型[1]。關于PF機制和治療的進展是近幾年的研究熱點，如：通過小分子靶向抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導，阻礙了轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)介導的纖維化作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導可能是調(diào)節(jié)成纖維細胞分化及其進一步參與PF發(fā)展的重要機制[2]；尼達尼布是特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonury fibrosis,IPF)已經(jīng)獲批的治療方法[3]，姜黃素是一種植物多酚，具有抗氧化、抗炎、降脂、抗腫瘤的作用。本文主要探討博萊霉素誘導的PF模型大鼠在應用姜黃素干預后，檢測TGF-β1在各組間的變化，從而探討姜黃素在PF中的作用機制，為我們進一步探討PF的發(fā)病機制及其防治提供一種新線索。

1 材料與方法

1.1 動物的選擇 健康雄性昆明大鼠96只，體重(20±2)g，由鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗期間為各組大鼠提供標準飼料、自由飲水，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強光的環(huán)境中。

1.2 試劑與儀器 姜黃素(四川金郁金科技有限公司生產(chǎn))；醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn))；注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會社生產(chǎn))；SABC二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠CTGF多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體等均購自武漢博士德公司。

1.3 建立肺間質(zhì)纖維化模型及建模后給藥 建模：健康SD雄性大鼠隨機分為4組，空白對照組(A)、模型組(B)、陽性藥物對照組(C，醋酸潑尼松片)和姜黃素干預組(D)，每組24只。B、C、D均一次性氣管內(nèi)給予博萊霉素(5mg/kg)制作肺纖維化動物模型，空白對照組以同樣方法一次性氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。28d后大鼠肺組織基質(zhì)沉積，呈纖維化表現(xiàn)。給藥：造模成功后，A、B組給予等量生理鹽水[0.014L/(kg·d)]，C組給予醋酸潑尼松混懸液[0.56mg/(kg·d)]，D組給予姜黃素羧甲基纖維素鈉混懸液[200mg/(kg·d)]。

1.4 HE、免疫組化染色

1.4.1 取材：腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉(2.5ml/kg)后將大鼠固定，快速取肺臟，冷生理鹽水清洗后，用15%的甲醛預固定肺左葉組織，抽真空后再用10%甲醛固定。經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋成蠟塊。并將分離出的肺右葉組織凍存到-80℃冰箱。

1.4.2 分別留取常規(guī)病理、免疫組化切片各1套。HE染色：經(jīng)過切片、展片、烤片、脫蠟、至水、染色。免疫組化：石蠟切片置烤箱60℃約1h，常規(guī)脫蠟至水，PBS洗滌5min， 過氧化氫3%孵育25min，PBS洗滌，5min×3次， 微波修復抗原，5%BSA封閉液滴加，室溫孵育30min。加稀釋的一抗TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體1∶300， 4℃冰箱過夜， PBS漂洗5min×3次。滴加羊抗兔生物素化標記的二抗，37℃孵育30min。PBS漂洗5min×3次， SABC復合液滴加，PBS再漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察，清水沖洗玻片， 37℃烘箱中烘干，封片，避光，1周內(nèi)采圖。免疫組化染色結(jié)果采用半定量分析。

1.5 Western-blotting測定方法 取0.1g肺組織，放入研缽，倒入適量液氮后用鉗子夾碎，倒入勻漿器，用0.4ml裂解液溶解粉末30min后，將裂解液移至1.5ml EP管中，放入離心機，12 000rpm，離心5min。取上清液，分裝于0.5ml EP管中后加入5x蛋白上樣液和DTT，混勻后，放入沸水中煮8min，取出冷卻后放入-20℃保存。灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交、發(fā)光鑒定、結(jié)果判斷。以β-actin為內(nèi)參照，將膠片進行掃描或拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(Mean ± SD)表示，P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 見圖1?？瞻讓φ战M大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見異常(圖A1)。模型組大鼠逐漸觀察到彌漫性肺纖維化和大量膠原沉積(圖B1)；陽性藥物對照組的肺組織纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，可見散在炎性細胞，肺泡間隔窄，纖維病灶可見于周圍支氣管(圖C1)。姜黃素干預組肺組織纖維化情況好轉(zhuǎn)明顯，纖維增生灶肺泡間隔較少。細支氣管周圍的纖維化程度明顯低于模型組(圖D1)。

圖1 HE染色×200

2.2 四組大鼠肺組織中TGF-β1表達免疫組化表達結(jié)果 見圖2。模型組在灌注BLM后28d TGF-β1表達水平達到高峰。模型組肺組織TGF-β1的表達較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物對照組和姜黃素干預組TGF-β1表達都明顯降低，但二者間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 TGF-β1表達變化

2.3 各組大鼠肺組織中TGF-β1表達Western blotting檢測結(jié)果 見圖3。與空白對照組相比，模型組大鼠肺組織中TGF-β1的表達均明顯升高；與模型組相比，陽性藥物對照組及姜黃素干預組大鼠肺組織中TGF-β1的表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 TGF-β1表達

3 討論

PF是一種纖維增生性疾病，最終可導致致命的肺衰竭。其特征在于成纖維細胞的異常增殖，成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化失調(diào)以及無組織的膠原和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、沉積和降解。其中以IPF發(fā)病率最高，預后較差，目前PF發(fā)病機制尚不明確并缺乏有效的治療策略。相關研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)與PF有密切關系：PF患者患肺癌的風險增加，TGF-β1信號傳導在組織纖維化和腫瘤發(fā)生中起重要作用，特別在IPF肺組織中，其介導的病理學變化可以促進致癌過程并提供有利于癌癥進展的微環(huán)境[4]。 另外一項研究觀察到博萊霉素(BLM)造模后第28天引起大鼠肺部出現(xiàn)炎癥浸潤和膠原沉積增加。施用PM014(一種草藥提取物)后的大鼠出現(xiàn)炎癥反應的抑制和纖維化變化。其可能是因為PM014抑制TGF-β1誘導的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細胞活化作用，或靶向調(diào)節(jié)了TGF-β1信號的傳導[5]。那么姜黃素在在肺纖維化方向的研究進展又是什么呢？姜黃素通過抑制促炎細胞因子和抑制NF-κB介導的炎癥而顯示出抗炎作用，一項研究利用可吸入姜黃素大多孔微粒來治療IPF[6]。肺纖維化與不可逆或部分可逆的氣流阻塞相關，并且最終對諸如皮質(zhì)類固醇的哮喘治療無反應，鼻內(nèi)姜黃素可調(diào)節(jié)慢性哮喘的氣道炎癥和重塑[7]。姜黃素可以在纖維化階段抑制BLM誘導的大鼠肺纖維化，其機制可能是抑制I型膠原蛋白的合成和沉積，抑制TGF-β1mRNA的過度表達。姜黃素對肺纖維化的治療效果優(yōu)于潑尼松[8]。在TGF-β超家族的亞家族中,TGF-β1是目前研究最多的與疾病相關分子，TGF-β1自1972年發(fā)現(xiàn)以來, 國內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)其在臟器纖維化、腫瘤、創(chuàng)傷修復、炎癥性疾病及自身免疫性疾病等發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[9]，在肺纖維化過程中扮演著重要角色，與肺纖維化關系密切。本實驗結(jié)果證實：肺纖維化模型組大鼠肺組織蛋白中TGF-β1含量明顯高于空白對照組，這與文獻報道結(jié)果一致。姜黃素干預組大鼠給予姜黃素后肺組織蛋白中TGF-β1的含量有一定程度的降低，與模型組比較，有顯著差異，這說明姜黃素能夠從蛋白水平調(diào)節(jié)肺組織TGF-β1的活性。陽性藥物對照組與姜黃素干預組肺組織中TGF-β1表達相似，差異無統(tǒng)計學意義。本研究初步探討了姜黃素抗肺纖維化的作用以及作用機制，也為臨床新藥的開發(fā)提供一種新的思路。另外該藥具有毒性低、價格低、藥源充足等優(yōu)點，具有良好的開發(fā)應用前景，但是肺纖維化的形成是一個慢性復雜的過程，需要進一步的實驗研究與臨床研究。