劉永浩 周 敏

南昌大學藥學院江西省基礎(chǔ)藥理學重點實驗室，江西省南昌市 330006

當心臟缺血后再次恢復(fù)血液供應(yīng)時，會造成大量心肌細胞損傷，即心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。MIRI直接影響患者的預(yù)后，其機制可能與鈣超載、氧自由基、細胞凋亡等[1]多種因素有關(guān)。燈盞花素(Bregenin,Bre)屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血等多種生物學活性，對腦組織、心肌、腎臟、肺等組織器官缺血再灌注損傷均表現(xiàn)出一定的保護作用[2-5]。目前燈盞花素對心肌MIRI保護作用機制仍不明確。本實驗通過利用原代心肌細胞擬建立缺氧/復(fù)氧(Anoxia/reoxygention,A/R)模型，以氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡為切入點，研究 Bre 對心肌細胞A/R損傷的保護作用機制，為下一步深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 燈盞花素(Bre)，中國藥品生物制品檢定所；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物制品有限公司；MTS，Ameresco公司；GSH-Px、SOD、MDA、LDH檢測試劑盒，南京建成生物工程研究；AnnexinV-FITC試劑盒，BD Biosciences；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗用原代心肌細胞 參照劉丹等[6]方法：選取1～3d新生大鼠的心臟處理后，剪成1mm2大小的碎泥狀，加8ml 0.1%的胰酶，37℃水浴8min，靜置數(shù)分鐘棄上清，重復(fù)多次，至碎塊消失，收集混懸液上清，用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)終止消化，離心(4℃，1 000rpm 8min)，收集細胞沉淀用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)混勻后，200目濾網(wǎng)過濾，常規(guī)培養(yǎng)2h，除去成纖維細胞，將上清用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)輕柔混勻，調(diào)整細胞數(shù)為5×105cells/ml，按2.5×106接種到60mm培養(yǎng)板中，放入細胞培養(yǎng)箱3d后，按照實驗要求進行分組實驗。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷模型的建立:將原代心肌細胞棄培養(yǎng)液，用缺氧液(5%CO2-95%N2混合氣體飽和)輕洗1次，再加入缺氧液并置于A/R裝置(持續(xù)充滿5%CO2-95%N2混合氣體)，37℃孵育3h后，棄去缺氧液，用復(fù)氧液(5%CO2-95%O2混合氣體飽和)清洗1次，再加入復(fù)氧液并置于A/R裝置，37℃孵育2h(缺氧液、復(fù)氧液參照Koyama[7]、Xu[8]等方法配制)。

1.3.2 實驗分組：(1)Control組(對照組)：原代心肌細胞常規(guī)培養(yǎng)箱(5%CO2-95%空氣)37℃孵育3h后，再換成復(fù)氧液置于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育2h；(2)A/R組(缺氧/復(fù)氧組)：按1.3.1方法建立A/R損傷模型；(3)Bre+ A/R組(燈盞花素組)：取原代心肌細胞分別加入濃度為20、40、80μM的燈盞花素，常規(guī)培養(yǎng)箱孵育24h，然后進行A/R損傷處理。

1.3.3 MTS比色法檢測細胞存活率：將已接種原代心肌細胞(覆蓋率70%～80%)的96孔培養(yǎng)板吸出培養(yǎng)基，每孔100μl培養(yǎng)基加入MTS溶液20μl(檢測步驟根據(jù)試劑盒說明書操作)，在常規(guī)培養(yǎng)箱孵育1～4h，490nm讀取吸光度值，記錄結(jié)果。

1.3.4 生化系列指標檢測：將各實驗組心肌細胞收集后，超聲破碎并離心，取上清，按照試劑盒說明書進行相關(guān)操作，將配制的溶液用分光光度計在特定波長(MDA 532nm，SOD 550nm，GSH-Px，LDH 412 nm)讀取吸光度值，記錄結(jié)果。

1.3.5 Annexin V-FICT/PI雙染法檢測心肌細胞凋亡：將前期處理收集的細胞用400μl的1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106cells/ml，添加5μl Annexin V-FITC，混勻后避光，置2～8℃冰箱孵育15min；加入10μl PI，輕混后再避光，置2～8℃冰箱孵育5min，在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對原代心肌細胞A/R損傷后細胞存活率、LDH 活性和細胞凋亡的影響 如表1所示，與對照組相比，A/R組細胞存活率明顯降低 (P<0.01)，培養(yǎng)液中LDH 活性明顯升高(P<0.01)，A/R損傷模型構(gòu)建成功；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)細胞存活率呈劑量依賴性升高(P<0.01)，培養(yǎng)液中LDH 活性逐漸降低(P<0.01)。與對照組相比，A/R 組細胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.01)，心肌細胞經(jīng)A/R損傷后凋亡明顯；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)凋亡細胞數(shù)明顯降低(P<0.01)。

表1原代心肌細胞A/R損傷后細胞存活率、LDH活性和細胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.01；與A/R 組比較，▲P<0.01。

2.2 燈盞花素對原代心肌細胞A/R損傷后SOD、GSH-Px和MDA含量的影響 如表2所示，與對照組相比，A/R 組細胞內(nèi)抗氧化物酶 SOD 及 GSH-Px 活性均明顯降低(P<0.01)，MDA的含量明顯增加(P<0.01)，A/R損傷模型建立成功；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)的抗氧化酶SOD 及 GSH-Px 的活性明顯增加(P<0.01)，MDA的含量明顯減少(P<0.01)。

表2原代心肌細胞A/R損傷后SOD和GSH-Px活性以及MDA含量的影響

注：與對照組比較，*P<0.01;與 A/R組比較，▲P<0.01。

3 討論

近年來，經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、體外循環(huán)心臟外科手術(shù)、動脈搭橋術(shù)、溶栓療法等手段的建立和推廣應(yīng)用，心臟在短時間內(nèi)缺血再次恢復(fù)血氧供應(yīng)過程中造成的心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，已成為影響心臟血管外科手術(shù)療效的一大難題。Fliss等[9]研究發(fā)現(xiàn)MIRI中心肌細胞死亡本質(zhì)上有可能是細胞凋亡。MIRI中細胞凋亡的發(fā)生與再灌注恢復(fù)氧供應(yīng)過程中的氧化應(yīng)激損傷[10-11]密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的過度產(chǎn)生所致的氧化應(yīng)激是造成細胞凋亡的關(guān)鍵[12]。機體內(nèi)抗氧化物酶可清除氧自由基，其中超氧化物歧化酶(SOD) 可清除超氧陰離子，而谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可清除脂質(zhì)過氧化物(MDA)，MDA可反應(yīng)氧自由基的含量。因此提高抗氧化物酶的活性、減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生可以抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，達到心肌細胞保護作用。

燈盞花素，具有抗心律失常作用，能抑制MIRI引起的細胞凋亡[13]。有研究表明，燈盞花素可通過清除氧自由基，減少氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮肝臟、腦組織MIRI保護作用[14-15]。在本實驗中，利用原代心肌細胞作為研究對象，A/R損傷前用燈盞花素進行預(yù)處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與A/R組相比，細胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性升高，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯減少，細胞存活率得到提高，細胞凋亡減少。實驗結(jié)果表明，心肌細胞經(jīng)過燈盞花素預(yù)處理能有效地提高其A/R損傷后的抗氧化物酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，抑制細胞凋亡，從而達到對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，燈盞花素心肌保護作用機制可能與其減少氧化應(yīng)激損傷，抑制細胞凋亡密切相關(guān)。本實驗為下一步深入探討燈盞花素心肌的保護作用機制提供了新的實驗數(shù)據(jù)。