楊佳麗，趙陽，杜麗，盧育新，程曉晨，潘自強，趙希榮* ，張慶林*

(1．淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇淮安223003;2．軍事科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京100850)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL．)為馬齒莧科馬齒莧屬植物，一年生肉質草本生物，民間稱其為長壽菜、螞蟻菜、瓜子菜等。馬齒莧鮮品含有生物堿、黃酮、多糖、多不飽和脂肪酸等成分，不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且具有提高人體免疫力、降血糖、降血脂、抗菌、治療濕疹、丹毒、熱毒血痢、癰腫療瘡等作用功效［1］。馬齒莧被稱為天然抗生素，據(jù)文獻報道馬齒莧黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。濕疹是常見的變態(tài)反應性炎癥性皮膚病，病因復雜多樣，其外部的細菌(如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等)及真菌感染會加重病情。由于濕疹病情反復，難以根治，嚴重影響患者的生活質量。在臨床治療中發(fā)現(xiàn)馬齒莧對濕疹療效顯著，目前治療濕疹采用的馬齒莧多為干品，少有關于馬齒莧鮮品對濕疹治療的研究。馬齒莧治療急性濕疹通常采用外洗方，存在滲透性差、不易清洗等問題。在研究過程中發(fā)現(xiàn)馬齒莧鮮汁提取物凍干品吸濕性較強，不易保存，限制了其使用。凝膠劑是一種常見的半固體制劑，由于本身的液體成分較多，可以克服鮮汁提取物吸濕性，具有黏附性好、滲透性強、易于清洗、患者易接受等優(yōu)點，是常用的劑型之一。本研究將馬齒莧鮮汁凍干品制成凝膠劑型，以卡波姆-940為主要載體，綜合凝膠劑的感官指標和實驗指標評分對馬齒莧鮮品凝膠劑制備工藝進行多因素考察，并采用正交試驗篩選出最佳處方。對馬齒莧鮮品凝膠進行抑菌實驗，觀察凝膠對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用。通過動物實驗，觀察馬齒莧鮮品凝膠對 2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitro-chlorobenzene，DNCB)所致小鼠急性濕疹模型的治療作用，旨在開發(fā)馬齒莧治療濕疹的新劑型。

1 材料與方法

1．1 儀器 臺式高速離心機(湖南湘儀，型號：H-1850R);pH計(MettlerToledo);光學顯微鏡(OlympusCX4lRF);-20℃低溫冰箱(海爾冰箱);超凈工作臺(北京昌平儀器公司);隔水型恒溫培養(yǎng)箱(天津泰勒斯特儀器公司);高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安儀器公司)。

1．2 實驗材料 卡波姆-940(上海麥克林生化科技有限公司);氧氟沙星膠囊(江西黃河藥業(yè));Tween-80(GFCOChemicalSupplies);復方黃柏液(江西蓋天靈藥業(yè));羥苯乙酯、1，2-丙二醇、氮酮及 2，4-二硝基氯苯(DNCB)均購自國藥集團化學試劑有限公司。金色葡萄球菌(ATCC25922)、大腸桿菌(ATCC29213)由本實驗室保存。

1．3 實驗動物 健康昆明小鼠40只，雌雄各半，體重(22±4)g，由軍事醫(yī)學研究院動物實驗中心提供［合格證號：SCXK(軍)2012-0004］，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院動物實驗中心。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在24℃左右，晝夜明暗交替時間為12h/12h，相對濕度保持在40%～70%;標準飼料和水供動物自由飲食。

1．4 馬齒莧鮮品凝膠的制備 將采購自江蘇的鮮馬齒莧榨汁，榨汁液濃縮凍干。將馬齒莧凍干品0．1 g、羥苯乙酯(少量無水乙醇溶解)0．1g、1，2-丙二醇5mL、Tween-800．1g 及氮酮 0．1g 置于研缽中研磨，研磨充分后加入凝膠基質攪拌［3］。用適量10%NaOH溶液調pH至6．5，總質量最終為50g。

1．5 馬齒莧鮮品凝膠的優(yōu)化

1．5．1 卡波姆的用量 按照“1．3”項下操作，設置不同濃度的卡波姆(0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%)，其他因素不變，平行制備5份凝膠劑，按照表1評分標準進行考察。

1．5．2 丙二醇的用量 按照“1．3”項下操作，設置不同濃度的丙二醇(5%、10%、15%、20%、25%)，其他因素不變，平行制備5份凝膠劑，按照表1評分標準進行考察［4］。

表1 卡波姆凝膠劑基質考察評分標準

1．5．3 pH 優(yōu)化 按照“1．3”項下操作，以 10%NaOH 為調節(jié)劑，設置不同的 pH 值(4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5)，平行制備 5 份凝膠劑，按照表 1 評分標準進行考察。

1．6 凝膠劑質量檢測 對于凝膠制劑處方評價的方式較為廣泛，如果采用單一的感官評價指標對凝膠劑的處方進行評價會顯得結果不夠準確［5］。本實驗在相關文獻基礎上，除了采用感官指標評價外，以理化指標(耐寒穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性及抗菌性)對凝膠質量進行評價。

1．6．1 離心試驗 取3批凝膠劑各5g置于離心管中，6000rpm離心15min取出，觀察凝膠有無分層及顏色變化。

1．6．2 耐寒試驗 取3批凝膠劑各5g置于-20℃冰箱中48h取出，觀察凝膠有無分層及顏色變化。

1．6．3 耐熱試驗 取3批凝膠劑各5g置于55℃水浴中2h取出，觀察凝膠有無分層及顏色的變化［6］。

1．6．4 凝膠劑抗菌活性 在無菌操作臺中，將金色葡萄球菌和大腸桿菌搖床培養(yǎng)過夜，計數(shù)并稀釋至106個/mL。吸取100μL稀釋后的菌液均勻涂布在固體LB培養(yǎng)基上，晾干后用無菌的打孔器打孔(直徑為7mm)。向孔內分別加30μL的生理鹽水作為陰性對照、陽性藥(氧氟沙星凝膠)，空白原位凝膠、馬齒莧鮮品凝膠及凍干馬齒莧(溶于生理鹽水)各0．5g，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h觀察抑菌圈。

1．7 小鼠濕疹模型 將小鼠隨機分為凝膠組、復方黃柏液組(HB組)、陰性對照組及正常組共4組，每組10只。在每只小鼠頸背部剪毛(面積2cm×2 cm)，除正常組外，其他3組小鼠去毛后當日及次日于去毛部涂5%DNCB(100μL/只)各一次致敏，第7天涂1%DNCB(100 μL/只)激發(fā)［7］。激發(fā) 24h后給藥，復方黃柏液組涂抹復方黃柏液(500 μL·cm-2)，陰性對照組涂抹等量生理鹽水，凝膠組涂抹0．5g馬齒莧鮮品凝膠，每天2次，連用7d。

1．8 皮膚組織病理檢查 給藥7d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠濕疹模型部位皮膚組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色。光學顯微鏡觀察皮膚組織病理改變［9］。

2 實驗結果

2．1 馬齒莧鮮品凝膠的優(yōu)化

2．1．1 卡波姆的用量 卡波姆的濃度為 0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%時，凝膠劑的評分分別為7．7、7．9、8．0、8．7、8．5，即卡波姆濃度為 0．7%最佳，結果見表2。

表2 不同濃度卡波姆凝膠基質的綜合評分

2．1．2 丙二醇的用量 丙二醇的濃度為5%、10%、15%、20%、25%時，凝膠劑的評分分別為 8．0、8．6、8．4、9．0、8．3，據(jù)此選擇丙二醇的濃度 20%，結果見表 3。

表3 不同濃度丙二醇凝膠基質的綜合評分

2．1．3 pH pH 為 4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5 時，凝膠劑的評分分別為 5．8、8．4、9．0、8．4、7．9、4．6，pH 值為6．5時凝膠劑評分最高，結果見表4。

2．2 正交試驗 根據(jù)以上單因素試驗結果，選擇卡波姆-940濃度(A)、丙二醇濃度(B)和pH值(C)作為考察影響凝膠劑的主要因素，每個因素設3個水平，按L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表5，正交試驗結果見表6。

試驗結果如表6所示，RA=RC＞RB各因素對試驗指標影響的主次順序是A=C＞B，即對凝膠劑影響較大的是卡波姆-940用量和pH。另外，正常皮膚是弱酸性的，表面pH一般維持在4．5～6．5。綜合以上因素，最終采用的制備工藝為A2B1C2，即卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5。

表4 不同pH凝膠基質的綜合評分

表5 因素水平表

表6 正交設計表

2．3 驗證試驗 用正交試驗優(yōu)選的工藝條件卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5 平行制備 3 批凝膠劑，綜合評分分別為 9．3、9．4、9．0。結果表明該制備工藝穩(wěn)定，后續(xù)實驗均采用此處方。

2．4 抑菌實驗 對金色葡萄球菌的抑菌實驗結果顯示(見圖1A)，馬齒莧鮮品凝膠、馬齒莧干品提取物和陽性對照均有抑菌圈出現(xiàn)，馬齒莧鮮品凝膠的抑菌圈明顯大于馬齒莧干品提取物，陰性對照和空白原位凝膠無抑菌圈;對大腸桿菌的抑菌實驗顯示(見圖1B)，馬齒莧鮮品凝膠和陽性對照孔有抑菌圈，而凍干馬齒莧、陰性對照和空白原位凝膠無抑菌圈出現(xiàn)。實驗結果表明，馬齒莧鮮品凝膠保留了馬齒莧的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用，而凝膠的抑菌作用可以幫助減緩濕疹的癥狀。

圖1 對金色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實驗結果

2．5 對小鼠急性濕疹治療研究 小鼠急性濕疹模型建立結果顯示，DNCB激發(fā)后陰性對照組皮膚出現(xiàn)紅腫、糜爛面、有明顯漿液性滲出，表明造模成功;HB組及馬齒莧鮮品凝膠組背部紅腫、糜爛等現(xiàn)象減輕，表明馬齒莧鮮品凝膠可以緩解急性濕疹的癥狀(見圖2)。光學顯微鏡觀察皮膚病理切片顯示(見圖3)，陰性對照組表皮增厚，顆粒層輕度肥厚，棘層細胞內水腫，真皮內炎細胞(淋巴細胞)浸潤明顯，符合急性濕疹病理改變。HB組棘層細胞內輕度水腫，真皮內有少量炎細胞浸潤，較陰性對照組癥狀明顯減輕。馬齒莧鮮品凝膠組顆粒層肥厚癥狀改善、棘層細胞內水腫明顯改善，真皮內炎細胞數(shù)量明顯減少。實驗結果顯示，馬齒莧鮮品凝膠可以有效抑制DNCB所誘發(fā)的小鼠急性濕疹反應，明顯減輕急性濕疹小鼠皮膚組織的炎癥反應，表明馬齒莧鮮品凝膠對急性濕疹有明確療效。

圖2 小鼠濕疹模型

3 討論

圖3 小鼠濕疹皮膚病理切片(HE，100×)

凝膠制劑系指藥物與能形成凝膠的輔料制成均一、混懸或乳狀液型的稠厚液體或半固體制劑。本研究首次將鮮品馬齒莧用于凝膠制備，解決了鮮品馬齒莧凍干品吸濕性強的問題。在凝膠劑制備中卡波姆-940用量會影響凝膠黏度和藥物釋放，pH值對外觀形狀有重要影響，丙二醇可作為凝膠劑的助溶劑和保濕劑，因此實驗中考察了不同卡波姆-940濃度、pH值及丙二醇濃度對凝膠劑質量的影響。通過正交試驗，確定凝膠劑的最優(yōu)配方即0．7%卡波姆，10%丙二醇，pH6．5。對優(yōu)化的馬齒莧鮮品凝膠進行了質量檢測，結果顯示制備的馬齒莧鮮品凝膠劑經(jīng)離心、耐寒及耐熱實驗，穩(wěn)定性良好，無分層及顏色變化。抑菌實驗結果顯示，凝膠劑型保留了馬齒莧的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯抑制作用，而凝膠劑的抑菌作用可以緩解濕疹的癥狀。

中醫(yī)認為濕疹多是由于風、濕、熱邪郁于局部，與氣血相互搏結形成，故選用清熱解毒，散血消腫等藥物治療。在濕疹的發(fā)病中以急性濕疹最為常見，發(fā)病時皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、水泡、糜爛、滲出，往往伴有劇烈的瘙癢［11］。有文獻報道馬齒莧可用于治療急性濕疹［10］，因此為了研究馬齒莧鮮品凝膠劑對濕疹的治療作用，采用DNCB反復激發(fā)建立了小鼠濕疹模型。馬齒莧鮮品凝膠涂抹給藥后，皮膚病理結果顯示，馬齒莧鮮品凝膠治療后濕疹皮膚的炎癥反應明顯減輕，表明馬齒莧鮮品凝膠對小鼠濕疹具有治療作用。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化成功制備了馬齒莧鮮品凝膠，抗菌實驗表明馬齒莧鮮品凝膠保留了馬齒莧的抑菌活性，進一步的動物實驗也表明其對小鼠濕疹具有明顯的治療作用，為馬齒莧治療濕疹研究提供研究基礎。然而，對馬齒莧鮮品凝膠劑的劑型研究，如體外釋藥、離體皮膚透皮等以及馬齒莧鮮品的有效成分等均有待于進一步研究。