史曉婧， 王延穩(wěn)， 曹慧

(1.偃師市人民醫(yī)院， 河南 洛陽(yáng) 471900； 2.新沂市鐵路醫(yī)院， 江蘇 新沂 221400)

缺氧引起的心肌梗死可引起心律失常、休克甚至心力衰竭，嚴(yán)重危害人類生命。心肌梗死后的重要組織病理學(xué)改變即心肌纖維化，在光鏡下可見白色纖維條、肌漿空泡化、內(nèi)膜組織增厚、或附壁性血栓，這些病理改變將導(dǎo)致心臟體積和僵硬度增加、舒張收縮功能降低、及電生理結(jié)構(gòu)失常，最終可誘發(fā)猝死[1-3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在心肌纖維化過程中起著重要作用，它主要通過調(diào)控心臟成纖細(xì)胞的分化、增加膠原的生成、促進(jìn)纖維連接蛋白的合成、增加細(xì)胞間質(zhì)的增生、或抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分解，最終促成纖維化[4-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化以及細(xì)胞衰老凋亡，并參與了心肌纖維化、心律失常、心肌肥厚等過程，在心血管疾病病理過程中意義重大， 已發(fā)現(xiàn)miR-808在心臟組織細(xì)胞中含量豐富，可通過調(diào)控TGF-β1改善心肌梗死后的心肌纖維化。本研究旨在探究miR-808通過調(diào)控TGF-β1改善心肌梗死后心肌纖維化的機(jī)制，為心肌纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，由天津疾病預(yù)防控制動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(津)2018-0004。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液及烏拉坦(美國(guó)Invitrogen公司)，TGF-β1及TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Gibcol公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及microRNA mimics/inhibitors，(美國(guó)ABI公司)，慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P生物有限公司)。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)BRAND公司)，超凈工作臺(tái)(北京長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備公司)，高壓蒸汽滅菌器及超低溫冰箱(日本三洋株式會(huì)社)，臺(tái)式冷凍干燥離心機(jī)(德國(guó)Thermo Scientific公司)，倒置相差/熒光顯微鏡及BHEC顯微鏡微機(jī)彩色圖像處理系統(tǒng)(購(gòu)自日本Olympus公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀及流式細(xì)胞儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及造模 70只大鼠分為對(duì)照組(10只)和心梗組(60只)，心梗組大鼠制作心肌梗死模型，對(duì)照組大鼠只做手術(shù)不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；心梗組大鼠腹腔注射25%烏拉坦(5 mL/kg)麻醉，暴露心臟，在距左冠狀動(dòng)脈起點(diǎn)處2～3 mm用手術(shù)線進(jìn)行結(jié)扎，術(shù)后每只大鼠注射40 000 U/d的青霉素，防止術(shù)后感染。造模后1周后，心梗組所有造模大鼠均轉(zhuǎn)染miRNA，以1×109TU/mL濃度的慢病毒對(duì)心肌組織進(jìn)行局部注射，劑量為40 μL，造模成功后的心梗組大鼠分為miR-808前體組(Pre-miR-808，40 μ mol/L)和miR-808抑制劑組(anti-miR-808，40 μmol/L)。ELISA試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA后的心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的分泌水平。轉(zhuǎn)染后1周取心臟組織，一半切片、一半進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)。大鼠飼養(yǎng)條件：專業(yè)鼠房，室溫24～26 ℃，濕度45%～55%，自由飲水、攝食，每日提供光照12 h，通風(fēng)良好，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。大鼠存活情況：模型組大鼠術(shù)后存活35只、5只死于麻醉過量、5只死于腹腔出血、12只死于室顫、3只死于急性心力衰竭。Control組大鼠無(wú)死亡。

1.2.2Masson染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變 轉(zhuǎn)染 miRNA后1周， 取心肌，Masson染色組織切片：心肌組織切片脫蠟水化、經(jīng)Bouin’s溶液56 ℃水浴1 h后水洗、Weigert蘇木素溶液處理20 min后水洗、麗春紅溶液處理5 min后水洗，1%磷鎢酸溶液和苯胺藍(lán)溶液分別處理8 min，最后經(jīng)1%冰醋酸溶液處理1 min，經(jīng)脫水透明后進(jìn)行圖像采集及分析。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 將所取大鼠心臟置于含40 000 U/L肝素的PBS溶液中漂洗3次，剃去結(jié)締組織，將心臟組織剪成1～2 mm3的組織塊，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入10倍體積的胰蛋白酶心肌細(xì)胞消化液，37 ℃培養(yǎng)箱消化15 min，收集消化后細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至等體積含有10% FBS+DMEM培養(yǎng)液中終止消化后重懸，10%FCS+DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于冰面上，PBS溶液洗2遍，每1×106～1×107個(gè)細(xì)胞加1 mL Trizol裂解液，冰水浴下加入RNA裂解液后根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA。術(shù)后1周實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TGF-β1、Furin蛋白和α-SMA的合成水平，引物如下。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織

術(shù)后1周，Masson染色心肌組織切片，可觀察到Control組的心肌細(xì)胞排列整齊且緊密，細(xì)胞間隙均勻，分布少量的藍(lán)色膠原，纖維組織橫紋清晰可見，炎性細(xì)胞少有浸潤(rùn)現(xiàn)象，如圖1a所示。心梗組心肌梗死區(qū)細(xì)胞明顯減少，邊緣區(qū)可觀察到心肌細(xì)胞代償性肥大，大量排列紊亂的結(jié)締組織增生和炎性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌纖維溶解或斷裂，大量膠原纖維沉積，如圖1b所示。miR-808前體侵染心梗組1周后，組織病變有明顯改善，心肌細(xì)胞增多，膠原纖維沉淀減少，如圖1c所示。

注：A為Control組，B為心梗組，C為miR-808前體侵染心梗組圖1 各組大鼠心肌組織(Masson，×100)Fig.1 Histopathological changes of myocardium in each group

2.2 心肌組織miR-808及TGF-β1表達(dá)

轉(zhuǎn)染后1周，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與Control組比較，心梗組心肌組織miR-808表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖2a所示。與Control組比較，心梗組心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖2b所示。

2.3 miRNA轉(zhuǎn)染心臟成纖細(xì)胞后TGF-β1通路的功能表達(dá)

如圖3所示， Pre-miR-808組與Control組比較、心臟成纖細(xì)胞TGF-β1的合成水平降低，且anti-miR-808組與Control組比較、心臟成纖細(xì)胞TGF-β1的合成水平提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-808前體能抑制心臟成纖細(xì)胞Furin的合成水平，而抑制miR-808可提高Furin的合成水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-808前體能抑制心臟成纖細(xì)胞α-SMA的合成水平，抑制miR-808能提高α-SMA的合成水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

(1)與Control組比較，P<0.05圖2 兩組大鼠心肌組織miR-808及TGF-β1 mRNA表達(dá)Fig.2 Changes of expression of microRNA-808 and TGF-beta 1 in rat myocardium

(1)與Control組比較，P<0.05;(2)與Control組比較，P<0.01圖3 心臟成纖維細(xì)胞中TGF-β1分泌及Furin合成水平Fig.3 Levels of TGF-beta 1 secretion and Furin synthesis in cardiac fibroblasts

3 討論

心臟中的細(xì)胞按功能可分為心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，占心臟細(xì)胞總數(shù)的90%，在正常條件下，心臟在這兩種細(xì)胞的動(dòng)態(tài)調(diào)控下運(yùn)行。心臟成纖維細(xì)胞主要通過傳遞細(xì)胞間或組織間的化學(xué)信號(hào)和電信號(hào)參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的代謝，在心臟重塑過程中起著關(guān)鍵作用[7-9]。心臟成纖維細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，病變過程中可由心外膜干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心內(nèi)膜干細(xì)胞等不同的細(xì)胞分化而來，激活后可分泌膠原[10]，但若膠原分泌以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積過度則會(huì)損害心臟功能，導(dǎo)致心室擴(kuò)張，心臟舒縮能力下降，最終發(fā)生心力衰竭[11-13]。miRNA可由miRNA的表達(dá)可由基因組中單拷貝、多拷貝或基因簇轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，其在不同細(xì)胞和組織中有特異性，在不同的發(fā)育階段也有特異性。例如miRNA的表達(dá)譜在血管中和心肌中不同，miR-1、miR-133、miR-26a、miR-126-3p和miR-30c是心肌中含量最高，miR-145、miR-23、miR-143和miR-125在血管中含量最高。近年來有研究報(bào)道，miRNA在心血管臨床病理病變過程中意義重大。Liu等[13]對(duì)小鼠miR-133a-1或miR-133a-2基因進(jìn)行敲除后發(fā)現(xiàn)，敲除后小鼠心室出現(xiàn)間隔缺損，伴隨心腔擴(kuò)大、室壁變薄等擴(kuò)張型心臟病變表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死1周后，心肌miR-808表達(dá)下降，表達(dá)不足空白對(duì)照組的1/10，而組織切片也顯示心臟成纖維細(xì)胞過度增生，心肌細(xì)胞凋亡，心肌收縮力下降，心肌纖維化等。而miR-808過表達(dá)組出現(xiàn)病變現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞增多，膠原纖維沉淀減少的現(xiàn)象。這說明miR-808可改善心肌梗死后心肌纖維化。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是細(xì)胞外基質(zhì)代謝調(diào)節(jié)和纖維化啟動(dòng)非常關(guān)鍵的細(xì)胞因子[17-19]。TGF-β1能通過刺激心臟成纖維細(xì)胞的分化，以及膠原產(chǎn)生和纖維連接蛋白合成、減少細(xì)胞外基質(zhì)分解來促進(jìn)纖維化[20]。對(duì)小鼠TGF-βl基因進(jìn)行敲除后，隨年齡增加心肌纖維化程度較正常小鼠有所減輕，心室順應(yīng)性有所改善[21]；然而TGF-β1過表達(dá)小鼠卻出現(xiàn)心肌病變，如心肌肥厚以及纖維化現(xiàn)象[22]。使用TGF-β1抑制劑或拮抗劑均可改善心肌纖維化，并提高心臟的舒張功能[23-24]?？赏ㄟ^TGF-β1的特異性受體拮抗劑改善心臟重塑和抑制纖維化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死組心臟成纖細(xì)胞中TGF-β1高表達(dá)，而miR-808過表達(dá)可抑制TGF-β1的高表達(dá)。

Furin是一種可水解蛋白的酶，通過Furin蛋白可調(diào)控血管緊張素Ⅱ?qū)GF-β1活化，使休眠期的TGF-β1喚醒，并修飾成為成熟的TGF-β1，為治療心肌纖維化提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)在心臟成纖維細(xì)胞中的miR-808可在mRNA水平上抑制Furin的表達(dá)，故本研究推測(cè)在心臟成纖維細(xì)胞中miR-808可能通過靶向作用于Furin蛋白來抑制TGF-β1激活進(jìn)而行使其功能。心臟成纖細(xì)胞分化成有更高合成膠原能力及收縮、遷移能力的肌樣成纖細(xì)胞是心肌纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵步驟，α-SMA是此分化過程中的標(biāo)志物。而其Smads信號(hào)通路是介導(dǎo)TGF-β1促纖維化作用的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。其作用機(jī)制主要為TGF-β1活化并結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受體，受體細(xì)胞胞漿區(qū)內(nèi)的Smads蛋白2、3被激活，Smad2、3活化后與Smad4結(jié)合形成蛋白聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，最終調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為明確miR-808抑制成纖細(xì)胞的分化過程，本研究對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-808后的心臟成纖細(xì)胞進(jìn)行了α-SMA表達(dá)的檢測(cè)。本研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-808能抑制α-SMA蛋白的表達(dá)，而抑制miR-808則能升高α-SMA的表達(dá)。故本研究推測(cè)在心臟成纖維細(xì)胞中miR-808可能通過靶向作用于α-SMA的表達(dá)來抑制TGF-β1激活進(jìn)而行使其功能。

綜上所述，心肌梗死后的心肌纖維化已被確定為心力衰竭發(fā)生的關(guān)鍵因素。TGF-β(纖維化疾病的病理介質(zhì))增加了心肌成纖維細(xì)胞中的miR-808表達(dá)，miR-808的過度表達(dá)減少了TGF-β的分泌和smad2/3磷酸化。此外，Smad2、3活化后與Smad4結(jié)合形成蛋白聚體是纖維化中miR-808的潛在靶點(diǎn)。故而，本研究認(rèn)為心肌成纖維細(xì)胞中的Smad2、3活化后與Smad4結(jié)合形成蛋白聚體由miR-808調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過Furin/TGF-β途徑，miR-808在心肌成纖維細(xì)胞功能和心肌纖維化中起著關(guān)鍵作用。因此，MIR-808可作為治療心肌梗死和其他纖維化心臟病的靶點(diǎn)。