柯東平， 朱金祥， 毛俊倩， 馬佳， 李建輝， 馬龍安**

(1.陜西省腫瘤醫(yī)院， 陜西 西安 710061； 2.陜西省人民醫(yī)院， 陜西 西安 710068)

結(jié)腸癌好發(fā)于乙狀結(jié)腸與直腸交界處，是最常見的胃腸惡性腫瘤之一，致死率極高[1]。對結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)、化療和放療綜合治療為主，盡管近年來診治水平有了一定的提高，但結(jié)腸癌患者的總生存率依然很低，且預(yù)后較差，對患者的健康造成了嚴(yán)重的威脅[2]。因此，加強(qiáng)結(jié)腸癌機(jī)制的研究，尋找新的治療靶點(diǎn)，對結(jié)腸癌的治療具有重要意義。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類小分子非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)相對應(yīng)的靶序列互補(bǔ)結(jié)合，促進(jìn)mRNA降解，發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用[3]。作為miRNA家族中的一員，miR-181d-5p能夠促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖[4-5]。已有研究表明，miR-181d-5p在結(jié)腸癌中呈高表達(dá)，提示miR-181d-5p在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但是關(guān)于其在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制尚不清楚[6]。因此，本研究擬在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞中沉默miR-181d-5p，探究miR-181d-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與主要試劑 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，第10染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)抗體、黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)抗體、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cellymphoma，Bcl-2)抗體、激活型半胱天冬蛋白酶3(cleaved Caspase-3)抗體、β-actin抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒購自沈陽萬類公司，p-FAK抗體購自中國CST，熒光素酶檢測試劑盒購自中國凱基公司，胎牛血清購自以色列BI公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，ECL發(fā)光液、胰酶購自中國碧云天公司，PBS購自中國雙螺旋公司，脂質(zhì)體2 000購自美國Invitrogen公司，熒光染料購自中國索萊寶公司，TRIpure總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄酶購自中國百泰克公司，脫脂奶粉購自中國伊利公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.1.2儀器 熒光定量PCR儀(型號Exicycler 96)購自韓國BIONEER公司，CO2培養(yǎng)箱(型號HF-90)購自中國上海力申公司，超速冷凍離心機(jī)(型號H-2050R)購自中國湖南湘儀公司，流式細(xì)胞儀(型號NovoCyte)購自美國Aceabio公司，多功能酶標(biāo)儀(型號M200Pro)購自瑞士TECAN公司，電泳儀(型號DYY-7C)、轉(zhuǎn)移槽(型號DYCZ-40D)、雙垂直蛋白電泳儀(型號DYCZ-24DN)、凝膠成像系統(tǒng)(型號WD-9413B)購自中國北京六一公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號DH36001B)購自中國天津泰斯特公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HCT116細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%左右，采用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；將細(xì)胞分為對照組、miR-181d-5p抑制物陰性對照組和miR-181d-5p抑制物組，分別接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，對照組正常培養(yǎng)，miR-181d-5p抑制物陰性對照組和miR-181d-5p抑制物組采用脂質(zhì)體2 000以100 pmol/L miR-181d-5p抑制物陰性對照或miR-181d-5p抑制物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，310 r/min離心5 min后，吸棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細(xì)胞，重復(fù)上述離心過程，殘留約50 μL的PBS。每管細(xì)胞樣品中加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，繼續(xù)加入5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V混勻，然后加入10 μL碘化丙啶混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞所占比例。

1.2.4Real-time PCR檢測細(xì)胞miR-181d-5p、PTEN、FAK、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，采用TRIpure總RNA抽提試劑提取樣本總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA樣本。根據(jù)人相應(yīng)基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。以cDNA產(chǎn)物作為模板，采用Real-time PCR檢測miR-181d-5p、PTEN、FAK、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件：5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，采用2-△△CT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析細(xì)胞miR-181d-5p、PTEN、FAK、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)。各基因引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Real-time PCR primer sequence

1.2.5Western blot檢測細(xì)胞中PTEN、FAK、p-FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，裂解液裂解，冰上靜置5 min，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉，分別加入PTEN、FAK、p-FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3一抗4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗37 ℃孵育45 min。ECL發(fā)光顯色，掃描膠片后采用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶光密度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)情況。

1.2.6生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-181d-5p和PTEN的調(diào)控關(guān)系 根據(jù)PTEN基因3′UTR序列信息，采用Targetscan分析軟件在線預(yù)測PTEN基因3′UTR是否含有miR-181d-5p的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建含PTEN基因3′UTR區(qū)熒光素酶報(bào)告載體(野生型PTEN)及其突變型載體(mut-PTEN)，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。將構(gòu)建完成的載體與miR-181d-5p模擬物或miR-181d-5p模擬物陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，即突變型PTEN3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物組、野生型PTEN3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物組、突變型PTEN3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物陰性對照組、野生型PTEN3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物陰性對照組；48 h后，裂解細(xì)胞，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，以熒火蟲熒光素的強(qiáng)度除以海腎熒光素的強(qiáng)度進(jìn)行均一化處理，并以野生型PTEN3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物陰性對照組為基準(zhǔn)，計(jì)算各組熒光素酶的相對活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MiR-181d-5p沉默誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡

與陰性對照組相比，miR-181d-5p抑制物組miR-181d-5pmRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陰性對照組miR-181d-5pmRNA表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-181d-5p抑制物組凋亡細(xì)胞明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對照組相比，陰性對照組凋亡細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

(1)與陰性對照組比較，P<0.01圖1 轉(zhuǎn)染miR-181d-5p抑制物后HCT116 細(xì)胞中miR-181d-5p的表達(dá)Fig.1 The expression of miR-181d-5p in HCT116 cells transfected with miR-181d-5p inhibitor

表2 MiR-181d-5p沉默對HCT116 細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effect of miR-181d-5p silencing on apoptosis of HCT116 cells

(1)與陰性對照組比較，P<0.01

2.2 MiR-181d-5p沉默對PTEN、FAK、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測PTEN、FAK、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比，陰性對照組PTEN、FAK、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對照組相比，miR-181d-5p抑制物組，PTENmRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但FAK和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.3 MiR-181d-5p沉默對PTEN、FAK、p-FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，陰性對照組PTEN、FAK、p-FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與陰性對照組相比，miR-181d-5p抑制物組PTEN、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，p-FAK、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但FAK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為對照組，B為陰性對照組， C為miR-181d-5p抑制物組圖2 各組CT116細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Cell apoptosis in each group

2.4 MiR-181d-5p與PTEN 3′UTR特異性結(jié)合

采用Targetscan分析軟件在線預(yù)測顯示，PTEN基因3′UTR含有miR-181d-5p的結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)結(jié)果顯示，與突變型PTEN 3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物組相比，野生型PTEN 3′UTR聯(lián)合miR-181d-5p模擬物組熒光素酶活性顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余3組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5和圖6。

(1)與陰性對照組比較，P<0.01圖3 MiR-181d-5p沉默對PTEN、FAK、Bcl-2、 Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of miR-181d-5p silencing on the expression of PTEN, FAK, Bcl-2 and Caspase-3 mRNA

3 討論

目前，國內(nèi)外研究認(rèn)為結(jié)腸癌主要是由環(huán)境、飲食以及生活方式與遺傳因素協(xié)同作用的結(jié)果，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[7-8]。隨著分子靶向治療研究的深入，探討影響結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子及其可能的機(jī)制將有助于后續(xù)治療手段的開發(fā)[9]。研究顯示，miRNA作為非編碼小分子RNA，在調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[10]，其中，miRNA-181是一個(gè)進(jìn)化中極其保守的明星分子，在控制細(xì)胞生長、凋亡及分化等生理病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[11-12]。已有研究顯示，miR-181a過表達(dá)能夠促進(jìn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長、遷移和侵襲[11]；miR-181d-5p通過PI3K/AKT途徑促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突生長[4]；在胰腺癌中，miR-181d-5p表達(dá)上調(diào)，敲除胰腺癌細(xì)胞中miR-181d-5p可上調(diào)NKAIN2表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及移植瘤的生長[5]；在喉癌中，miR-181d-5p表達(dá)明顯升高，并通過靶向LCRG1增強(qiáng)Hep2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[12]；在結(jié)腸癌中，miR-181d-5p表達(dá)上調(diào)，沉默miR-181d-5p可以在體內(nèi)外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成和代謝，然而，其具體的作用機(jī)制尚不明確[6]。因此，為明確miR-181d-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，本研究采用miR-181d-5p抑制物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，抑制miR-181d-5p的表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-181d-5p沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，miR-181d-5p沉默后，結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率明顯提高。此外， Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡重要的調(diào)控因子，可通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌癥的發(fā)展[13]；凋亡被定義為半胱天冬蛋白酶(Caspase)依賴的程序性死亡[14]，其中Caspase-3是Caspase家族中與凋亡關(guān)系最為密切的成員，正常情況下以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)才被激活為有活性的Caspase-3，通過降解包括聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在內(nèi)的底物蛋白，不可逆地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，沉默miR-181d-5p能夠下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3的活化，表明沉默miR-181d-5p能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

注：A為Western blot檢測PTEN、FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，1為對照組， 2為陰性對照組，3為miR-181d-5p 抑制物組；B為凝膠圖象處理系統(tǒng)分析條帶光密度值，與陰性對照組比較，(1)P<0.01圖4 MiR-181d-5p沉默對PTEN、FAK、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of MiR-181d-5p silencing on the expression of PTEN, FAK, Bcl-2, and cleaved Caspase-3 proteins.

圖5 MiR-181d-5p在PTEN3′UTR上結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Predicted binding site of miR- 181d-5p on PTEN 3′UTR

注：A為，B為，C為，D為；(1)與突變型PTEN 3′UTR+ miR-181d-5p模擬物組組比較，P<0.01圖6 轉(zhuǎn)染不同重組載體質(zhì)粒熒光素酶活性Fig.6 Transfection of different recombinant vector plasmid luciferase activity

有資料顯示，miRNA通過降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，在調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生命活動中發(fā)揮重要作用[16]。為探究miR-181d-5p影響細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究首先利用生物學(xué)軟件在線預(yù)測，顯示PTEN可能是miR-181d-5p的靶基因，然后采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，含有PTEN基因3′UTR區(qū)熒光素酶報(bào)告載體和miR-181d-5p模擬物共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光素酶活性顯著降低，以上結(jié)果表明，miR-181d-5p能夠作用于PTEN的3′UTR，miR-181d-5p可能通過靶向作用PTEN 3′UTR區(qū)調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。PTEN是一個(gè)具有雙重特異性磷酸酶活性和酪氨酸酶活性的抑癌基因，控制與細(xì)胞增殖、周期、凋亡等一系列生理病理過程[17]。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，定位于整合素構(gòu)成的灶性粘附復(fù)合體上，具有多種功能[18]。已有研究表明，F(xiàn)AK為PTEN下游信號分子，PTEN蛋白可通過調(diào)節(jié)FAK等信號分子的磷酸化水平影響癌細(xì)胞增殖、凋亡等情況[19-20]。本研究結(jié)果顯示，沉默miR-181d-5p能夠促進(jìn)PTENmRNA和蛋白的表達(dá)，抑制FAK磷酸化，這一結(jié)果表明沉默miR-181d-5p通過PTEN-FAK途徑促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究初步探討了miR-181d-5p可通過靶向作用PTEN抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，可能成為結(jié)腸癌臨床分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。