夏鳳瓊， 楊國珍， 黃健， 林明春， 肖禮紅

(1.貴州省骨科醫(yī)院 檢驗科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 生化科， 貴州 貴陽 550004)

隨著全球工業(yè)化的迅速發(fā)展，人類生殖健康受到的威脅日漸突出，男性精液質(zhì)量下降十分顯著[1]。三聚氰胺作為一種不可缺少的工業(yè)化學(xué)品，廣泛地用于塑料、涂料、膠水、阻燃劑等行業(yè)，由于其含氮量高，再加上現(xiàn)有凱氏定氮法檢測蛋白質(zhì)含量的缺陷，許多不法分子便趁機(jī)將三聚氰胺添加于食品中來提高食品的含氮量[2]，從而威脅人類健康[3]。研究表明，三聚氰對寵物貓、狗及實驗兔、鼠、豬具有一定的急性皮膚毒性、吸入毒性、眼睛刺激、腎臟毒性及肝臟毒性[4-9]；也有研究表明三聚氰胺可降低雄性小鼠體液免疫功能[10]，對雌性大鼠具有卵巢毒性[11]。關(guān)于三聚氰胺在生殖毒性方面的研究報道甚少，本研究以健康雄性昆明種小鼠為對象，用不同劑量的三聚氰胺通過灌胃對小鼠進(jìn)行染毒，檢測小鼠睪丸組織的病理變化、睪丸細(xì)胞凋亡百分率及凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax、caspase-3的表達(dá)，初步探討三聚氰胺對雄性小鼠的生殖毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物主要試劑和儀器

1.1.1實驗動物 選擇6～8周齡健康雄性昆明種小鼠50只，體質(zhì)量25～30 g，購自于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK(渝)2001-0005。

1.1.2主要試劑和儀器 三聚氰胺(Sigma 公司，美國)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickingson公司)，Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒(Santa Cruz 公司，美國)，Caspase-3免疫組化試劑盒(Cell Signaling公司，美國)，免疫組化二抗、AB顯色系統(tǒng)(武漢博士德生物工程有限公司)，顯微照相系統(tǒng)(四川大學(xué)Biomias圖像分析軟件)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型 將50只雄性小鼠隨機(jī)均分為陰性對照組、實驗組(三聚氰胺低、中、高劑量組)及陽性對照組。陰性對照組按0.1 mL/10 g體質(zhì)量灌胃生理鹽水，實驗組分別按400、800、1 600 mg/kg體質(zhì)量灌胃三聚氰胺，陽性對照組按40 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射環(huán)磷酰胺。各劑量組按照體重每天定時給藥1次，連續(xù)5 d。

1.2.2標(biāo)本采集 于第一次染毒結(jié)束后的第35天，頸椎脫臼處死小鼠，立即剪開腹腔取出兩側(cè)睪丸，用生理鹽水洗凈睪丸上的血液，濾紙擦干，左側(cè)睪丸置于10% 中性甲醛中固定3 d后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋制成切片；右側(cè)睪丸-20 ℃保存 ，用于檢測睪丸細(xì)胞凋亡。

1.2.3HE染色 左側(cè)睪丸組織切片采用與脫水、透明相反的步驟脫蠟至水，蘇木素溶液染色10 min，自來水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，再經(jīng)伊紅染色。切片經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。光鏡下觀察小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4凋亡檢測 細(xì)胞懸液的制備 取小鼠 右側(cè)睪丸組織，剔除表面結(jié)締組織，消去被膜，加入適量的PBS，用眼科剪將睪丸剪碎，吸管吹打混勻，100目尼龍網(wǎng)過濾，800 r/min離心5 min，棄上清液，組織沉淀用PBS洗2次，制成細(xì)胞懸液(濃度為105～107/ml)。細(xì)胞懸液中加入5 μL 標(biāo)記有異硫氰酸熒光素(FITC)的Annexin V，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻、避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測，計算睪丸細(xì)胞凋亡率。

1.2.5免疫組化 左側(cè)睪丸組織切片采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色法檢驗。光鏡下，細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個視野，測得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達(dá)的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織學(xué)

顯微鏡下結(jié)果顯示，陰性對照組小鼠睪丸組織曲細(xì)精管完整、排列整齊，可見精原細(xì)胞和不同發(fā)育階段的精母細(xì)胞、精子細(xì)胞及成熟精子，各級細(xì)胞排列緊密，層次分明(圖1A)。三聚氰胺各劑量組睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)隨著染毒劑量的增加出現(xiàn)不同程度的損傷：低劑量染毒組損傷較不明顯，各級生精細(xì)胞排列較有序，管腔中成熟精子數(shù)量減少(圖1B)；中劑量染毒組可見生精細(xì)胞層數(shù)減少，管腔中精子數(shù)量減少(圖1C)；高劑量染毒組生精細(xì)胞排列紊亂、疏松，層數(shù)減少，管腔中精子數(shù)量減少(圖1D)；陽性對照組生精細(xì)胞層數(shù)減少，管腔中精子數(shù)量減少(圖1E)。

圖1 各組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)變化情況(HE，×400)Fig.1 Changes of testicular structure of mice in each group

2.2 蛋白Bcl-2 、Bax 及 Caspase-3表達(dá)

隨著染毒劑量的增加，三聚氰胺低、中、高劑量染毒組Bcl-2陽性表達(dá)較陰性對照組逐漸減少(灰度值升高)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三聚氰胺中、高劑量組Bax、Caspase-3較陰性對照組其反應(yīng)隨染毒劑量增加而增強(qiáng)(灰度值降低)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。應(yīng)用BioMias圖像分析系統(tǒng)對各組實驗結(jié)果進(jìn)行檢測。在40倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個視野(圖2)，測得Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性表達(dá)的平均灰度值。見表1。

注：箭頭所示為陽性表達(dá)圖2 各組小鼠睪丸組織中bcl-2、bax、caspase-3表達(dá)(SABC，×200)Fig.2 Expression of bcl-2, bax and caspase-3 in each group of mice testis

組別睪丸組織蛋白表達(dá)Bcl-2BaxCaspase-3陰性對照組127.84±12.95 133.06±11.36 149.75±5.33 陽性對照組150.98±7.86(1) 109.54±5.65(1)129.70±7.22(1)三聚氰胺低劑量組139.03±5.08(1)(2)129.17±9.08(2)145.65±5.06(2)三聚氰胺中劑量組139.90±5.56(1)(2)114.40±8.50(1)131.20±14.38(1)三聚氰胺高劑量組141.15±9.23(1)(3)112.14±6.25(1)133.45±4.21(1)

(1)與陰性對照組比較，P<0.05；(2)(3)與陽性組比較，P<0.05

2.3 睪丸細(xì)胞凋亡率

隨著染毒劑量的增加，各實驗組睪丸細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢，其中三聚氰胺高劑量組(23.404±3.488)與陰性對照組(16.871±3.610)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，三聚氰胺低、中劑量組[(18.441±2.841)、(19.486±3.133)]與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

注：A為陰性對照組，B為三聚氰胺低劑量組，C為三聚氰胺中劑量組，D為三聚氰胺高劑量組，E為陽性對照組圖3 各實驗組睪丸細(xì)胞凋亡率Fig.3 Testicular cell apoptosis rate of different groups

3 討論

檢測化學(xué)品暴露對組織有無影響常采用的方法是病理學(xué)檢查[12-13]。本次實驗中所采用的化學(xué)暴露品是三聚氰胺，結(jié)果顯示不同劑量的三聚氰胺對各組小鼠的睪丸組織產(chǎn)生了不用程度的病理損傷。其中，生理鹽水(空白)對照組小鼠睪丸組織管腔內(nèi)可見到大量成熟的精子細(xì)胞，生精小管及生精細(xì)胞排列規(guī)則、清晰；三聚氰胺低劑量組睪丸組織無明顯的病理學(xué)變化；三聚氰胺中劑量組可見到睪丸組織管腔中生精細(xì)胞數(shù)量減少，層數(shù)減少，生精小管排列紊亂；高劑量組小鼠睪丸組織已發(fā)生明顯萎縮。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD)。正常的細(xì)胞凋亡過程對機(jī)體并無有害影響。但是外界的有害物質(zhì)可使機(jī)體啟動異常的凋亡程序，對機(jī)體產(chǎn)生不可逆的損傷。

雖然細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體正常代謝所必須的，但是生精細(xì)胞的凋亡發(fā)生明顯增加則可能影響精子的正常生成而引起不育[14]，各種理化因素增加睪丸生精細(xì)胞凋亡，常常引起睪丸組織發(fā)生損傷[15]。在本次研究中，各組小鼠暴露于不同劑量的三聚氰胺后睪丸生精細(xì)胞均發(fā)生的不同程度的凋亡，并且隨著劑量的增加而增加。因此，本次研究表明，三聚氰胺可能誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸生精細(xì)胞發(fā)生凋亡。

免疫組化結(jié)果表明，各劑量組小鼠睪丸組織促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)均增加，中、高劑量組增加顯著；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)卻明顯降低。因此，本次研究中，雄性小鼠睪丸組織生精細(xì)胞的凋亡可能是抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少及促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達(dá)增加有關(guān)。

綜上所述，三聚氰胺對雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用：睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理損傷，管腔中生精細(xì)胞凋亡率增加，抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白表達(dá)異常，從而可能進(jìn)一步引起小鼠精液質(zhì)量的下降和精子數(shù)量的減少，對雄性小鼠具有一定的生殖毒性作用。