鄭藝， 楊爽， 黃晏軍， 湯長寧， 劉杰麟**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室, 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細(xì)胞中心, 貴州 貴陽 550004)

近年來，發(fā)現(xiàn)了多種衰老相關(guān)疾病基因，其中人類早老癥相關(guān)基因研究進(jìn)展最為突出。研究發(fā)現(xiàn)，解旋酶基因突變是早老癥主要病因，RecQ解旋酶家族在核酸代謝過程中起了關(guān)鍵的作用，這一家族參與DNA復(fù)制、修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄和維持端粒穩(wěn)定[1]。Blm解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的重要成員，在維持染色體的穩(wěn)定性中具有重要作用，Blm解旋酶的缺失可導(dǎo)致Blm綜合征(bloom’s syndrome，BS)[2]。Blm綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，其臨床特征為生長遲緩、學(xué)習(xí)障礙、免疫缺陷等，Blm綜合征患者突出表現(xiàn)為特征性骨改變，包括骨質(zhì)疏松癥、手指關(guān)節(jié)變硬、鎖骨的重吸收和纖維化、趾骨末端的重吸收等明顯的早老特征，這類患者可伴發(fā)惡性腫瘤。Blm綜合征患者常見免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)低下或免疫功能缺陷。將Blm患者的淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可發(fā)現(xiàn)高比率的染色體畸變，染色體有變脆、易斷裂傾向[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Blm解旋酶的低表達(dá)可以上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，而P53是腫瘤抑制基因之一[4]。Blm基因定位于染色體15q26.1，編碼蛋白相對分子質(zhì)量為159 kDa，是由1 417個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，在DNA重組中Blm可促進(jìn)同源重組中間物質(zhì)的溶解及阻止鏈的交叉，在DNA修復(fù)中Blm主要在細(xì)胞S期感知并應(yīng)對DNA損傷[5]。本文通過制備衰老小鼠模型，檢測衰老小鼠造血系統(tǒng)中Blm蛋白含量，并與正常發(fā)育小鼠比較，探討B(tài)lm解旋酶在衰老小鼠中的變化。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

C57BL/6小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心外購后提供，合格證號SCXK-(軍、PF級、8周齡、體質(zhì)量18～22 g。D-半乳糖(D-gal)、蘇木素-伊紅(H-E)染色試劑盒、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、封閉血清等均購自北京索萊寶科技有限公司,總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒及丙二醛(MDA)測試盒購自南京建成生物工程研究所,兔抗人Bax多克隆抗體及兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司,兔抗人Blm多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，5810-R型臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf Germany公司)，電泳儀、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)，曝光機(jī)(美國Bio-Rad公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，LEICA-RM2200切片機(jī),LEICA-EG1150石蠟包埋機(jī)，顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及小鼠衰老模型構(gòu)建 20只小鼠均分為正常對照組和衰老組，雌雄各半，衰老組小鼠構(gòu)建衰老模型。將D-半乳糖粉末1 g溶于10 mL的無菌生理鹽水中，使藥物濃度達(dá)到100 g/L，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存。造模時(shí)間共49 d，每天按 0.5 mg/g的劑量頸后部皮下注射D-半乳糖溶液；對照組按同樣方法注射等量的生理鹽水。

1.2.2小鼠一般情況、脾臟和胸腺組織形態(tài)觀察 逐日觀察兩組小鼠的狀態(tài)、進(jìn)食量及飲水量,造模期間每6 d記錄1次小鼠體質(zhì)量，共記錄10次小鼠體質(zhì)量。連續(xù)注射7周后，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔和胸腔暴露脾臟和胸腺，小心剝離出完整的脾臟和胸腺，利用蘇木素-伊紅(H-E)染色的方法做小鼠脾臟和胸腺組織切片。

1.2.3血清超氧化物氣化酶及丙二醛水平檢測 連續(xù)注射7周后，頸椎脫臼處死小鼠，摘眼球取血將小鼠血液收集到干燥清潔的EPP管中，做好標(biāo)記，4 ℃靜置2 h，低溫離心(4 ℃，1 500 rpm/min，8 min)，吸取上層血清至新的EPP管中。利用黃嘌呤氧化酶法檢測小鼠血清中SOD含量，采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定小鼠血清中MDA含量。

1.2.4Western blot檢測小鼠肝臟、脾臟和骨髓Blm蛋白表達(dá)水平 連續(xù)注射7周后，分別取對照組和衰老組小鼠的肝臟、脾臟和骨髓，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，8% SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上、將PVDF膜浸入封閉液，室溫封閉2 h，吸出封閉液后分別加入一抗BLM(1∶200)及β-actin 抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜、洗膜(洗3次，每次10 min)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL發(fā)光液，曝光。用Graphpad Prism軟件對曝光條帶進(jìn)行分析，目標(biāo)蛋白半定量用該蛋白與β-actin的吸光度比值表示。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠肝臟、脾臟和骨髓的Blm蛋白表達(dá) 造模完成后分別取對照組和衰老組小鼠的肝臟、脾臟和股骨，股骨經(jīng)脫鈣處理后與肝臟和脾臟一起脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，DEPC抗原熱修復(fù)(95 ℃，5 min)，室溫下過氧化氫封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化氫酶，加入山羊血清，37 ℃孵育30 min，滴加Blm抗體(1∶200)，4 ℃濕盒過夜。復(fù)溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃下孵育30 min。PBS沖洗5 min×3次，將玻片浸入DAB溶液中顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片。在400倍顯微鏡下觀察小鼠各組織切片的組織學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老小鼠模型的鑒定

2.1.1一般情況 造模末期對照組小鼠皮膚彈性好，毛發(fā)細(xì)密不易脫落，反應(yīng)靈敏、進(jìn)食正常；衰老組小鼠皮膚松弛、毛發(fā)粗糙失去光澤且易脫落，精神萎靡，喜蜷縮，脊椎逐漸隆起，體形消瘦、進(jìn)食少，見圖1。對照組小鼠的初始平均體質(zhì)量為(20.1±0.19)g，造模結(jié)束時(shí)的平均體質(zhì)量為(30.1±0.24)g，小鼠平均體質(zhì)量的增長為10.0 g；衰老組小鼠的初始平均體質(zhì)量為(20.2±0.07)g，造模結(jié)束時(shí)的平均體質(zhì)量為(28.6±0.11)g，小鼠平均體質(zhì)量的增長為8.4 g。衰老組小鼠和外觀形態(tài)特征、生存狀態(tài)和體質(zhì)量的改變，初步證明D-半乳糖衰老小鼠模型構(gòu)建成功。

2.1.2血清SOD和MDA含量 衰老小鼠模型制備完成后，衰老組小鼠血清SOD含量[(105.3±4.8)U/mL]較對照組小鼠 [(174±5.4)U/mL]明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);衰老組小鼠MDA含量[13.3±0.31(μmol/L)]較對照組小鼠[(4.72±0.42) μmol/L]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.3肝組織中Bax蛋白表達(dá) 衰老組小鼠的肝臟切片中Bax蛋白的陽性表達(dá)(棕褐色顆粒)高于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 兩組小鼠肝組織Bax蛋白表達(dá)(SP，×400)Fig.1 Bax protein expression of mice in the two groups

2.1.4脾臟和胸腺組織學(xué) 對照組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓和紅髓清晰，脾小梁沒有增生，脾臟中淋巴細(xì)胞數(shù)目眾多且形態(tài)正常，淋巴細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，色澤均一穩(wěn)定；衰老組小鼠白髓和紅髓不清，脾小梁明顯增生，淋巴細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞核發(fā)生固縮，表明淋巴細(xì)胞壞死增多。對照組小鼠胸腺包膜完整，皮質(zhì)和髓質(zhì)清晰；衰老組小鼠胸腺結(jié)構(gòu)分散，胸腺細(xì)胞分布稀疏，皮質(zhì)和髓質(zhì)不清，說明D-半乳糖衰老小鼠模型構(gòu)建成功。見圖2。

2.2 Blm基因在小鼠肝臟、脾臟和骨髓中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印記兩種方法都表明，衰老小鼠肝臟、脾臟和骨髓的Blm表達(dá)量低于對照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3、4。

3 討論

近年來，世界人口老齡化程度日益加深，隨著科學(xué)水平的不斷發(fā)展，許多學(xué)者希望能夠探索更多的衰老相關(guān)機(jī)制。建立適合的衰老動物模型是確保研究準(zhǔn)確、高效進(jìn)行的前提。研究證實(shí)，通過D-gal致衰老的造模方法所制備的衰老動物模型與自然衰老動物有較高相似性。D-半乳糖是一種小分子單糖，在體內(nèi)的量正常時(shí)是一種生理營養(yǎng)成分，可被氧化為葡萄糖，為機(jī)體提供能量[6-7]，但是，當(dāng)機(jī)體中D-半乳糖量過高時(shí)，氧化反應(yīng)會使D-半乳糖被氧化成醛糖和過氧化氫，產(chǎn)生超氧陰離子和氧自由基，從而導(dǎo)致機(jī)體生理功能發(fā)生改變。表現(xiàn)出與衰老相似的癥狀[8]。相關(guān)研究表明機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度升高，在酶的催化下還原成半乳糖醇，半乳糖醇不能被細(xì)胞代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞滲透壓發(fā)生改變，細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，加速衰老和凋亡[9]。

注：A為對照組小鼠脾臟，B為衰老組小鼠脾臟，C為對照組小鼠胸腺，D為衰老組小鼠胸腺圖2 兩組小鼠脾臟和胸腺組織學(xué)(SP，×400)Fig.2 Histology of spleen and thymus of mice in the two groups

注：A、B分別為衰老組和對照組小鼠肝臟Blm表達(dá)，C、D分別為衰老組和對照組小鼠脾臟Blm表達(dá)，E、F分別為衰老組和對照組小鼠骨髓Blm表達(dá)圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠肝臟、脾臟和骨髓中組織Blm的表達(dá)(SP，×400)Fig.3 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by immunohistochemistry

人類RecQ解旋酶基因家族包括RecQL1、RecQL5、Blm、Wrn及RecQL4 5個(gè)成員，后三者的突變均導(dǎo)致了相關(guān)的疾病，依次為Bloom綜合征、Werner 綜合征和RTS綜合征[10-11]。Sharma等[12]發(fā)現(xiàn)，Blm解旋酶具有促進(jìn)細(xì)胞DNA復(fù)制、修復(fù)、重組以及維持基因組穩(wěn)定性的功能。對秀麗隱桿線蟲的研究發(fā)現(xiàn)，基因確實(shí)可以影響生物的衰老及壽命，衰老的發(fā)生機(jī)制并非由單一基因決定，可能是一個(gè)基因群[13]。細(xì)胞衰老是生物衰老的基本單位，是老年病發(fā)病的共同基礎(chǔ)，細(xì)胞衰老與機(jī)體衰老直接相關(guān)。中老年癌癥發(fā)病率較高，癌癥是一種與衰老有關(guān)的疾病，衰老生物學(xué)與癌癥生物學(xué)存在著許多相似之處，癌癥與衰老的分子學(xué)機(jī)制又有著相互重疊的方面。因此，有關(guān)衰老的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制的研究對于癌癥的發(fā)生機(jī)制和抗腫瘤研究均具有重要價(jià)值。Blm解旋酶在與衰老有關(guān)的DNA損傷修復(fù)、端粒維護(hù)及線粒體功能障礙等方面發(fā)揮了重要作用[14-15]。因此，Blm可能在癌癥和衰老中發(fā)揮橋梁作用。孟惠惠等[16]發(fā)現(xiàn)，3 株腫瘤細(xì)胞株中均高度表達(dá)Blm mRNA及蛋白。Wang 等[15]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中Blm表達(dá)高于正常組織。Yan 等[11]研究表明，食管鱗癌細(xì)胞中BLM 表達(dá)上調(diào)2.927 倍，提示Blm的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

注：A為小鼠肝臟，B為小鼠脾臟，C為小鼠骨髓；(1)與對照組比較，P<0.05圖4 各組小鼠肝臟、脾臟和骨髓組織中Blm表達(dá)(Western Bolt)Fig.4 The expressions of Blm protein in the liver, spleen and bone marrow of mice detected by Western Bolt

SOD是體內(nèi)的抗氧化酶，可清除體內(nèi)氧自由基，SOD活力下降，不能消除過多的活性氧自由基(ROS)，ROS堆積過多后引起細(xì)胞損傷甚至凋亡，小鼠體內(nèi)SOD的含量可反應(yīng)小鼠的衰老程度。衰老小鼠血清中脂質(zhì)過氧化物丙二醛MDA的含量明顯增高，MDA能夠間接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度。本研究通過連續(xù)注射D-半乳糖，制造衰老小鼠模型，并通過檢測衰老模型組小鼠的生存狀態(tài)、體重變化、血清中SOD、MDA含量、Bax蛋白表達(dá)量、脾臟和胸腺組織形態(tài)學(xué)切片的觀察和檢測，與對照組小鼠比較，確定小鼠衰老模型構(gòu)建成功。獲得衰老小鼠模型后，采用石蠟切片免疫組織化學(xué)染色和蛋白印跡兩種方法分別對模型組小鼠和對照組小鼠的肝臟、脾臟和骨髓做了Blm表達(dá)的定位、定性、半定量對比分析，最終得出結(jié)論，衰老小鼠體內(nèi)Blm的表達(dá)低于正常對照組小鼠。綜上所述，Blm解旋酶含量的改變可能與衰老發(fā)生的機(jī)制相關(guān)。