劉芳， 王彩霞， 綦廷娜， 吳芳草， 文學(xué)琴， 陳崢宏*， 崔古貞*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是由澳洲醫(yī)師Warren和Marshall從胃黏膜組織樣本中培養(yǎng)并分離獲得的一種定植于胃黏膜上皮細(xì)胞表面的微需氧、革蘭陰性螺旋桿菌[1]。已有研究表明，慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)的主要病因與H.pylori感染相關(guān)，胃癌的發(fā)生亦與其有密切聯(lián)系[2-3]。有研究表明，H.pylori的致病作用及所致疾病和進(jìn)展與多種因素有關(guān)，包括細(xì)菌的毒力因子、細(xì)菌黏附與定植、宿主炎癥與免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡及細(xì)菌自身的基因多態(tài)性等[4-5]。目前診療指南均推薦確診為H.pylori感染者采用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)或(和)鉍劑聯(lián)合兩種抗生素的三聯(lián)或(和)四聯(lián)療法進(jìn)行根除治療，常用抗生素有克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑等。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，H.pylori對常用抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致H.pylori的根除效果不佳[6]，如果能明確H.pylori致病及耐藥的分子機(jī)制，則有望實現(xiàn)精準(zhǔn)治療。開發(fā)快速簡便的分子生物學(xué)檢測方法是研究H.pylori感染機(jī)制的先決條件，菌落PCR檢測是一種從大量樣品中快速鑒定和分析目標(biāo)基因型的實用方法，已應(yīng)用于分子生物學(xué)的許多領(lǐng)域[7-8]，如基因擴(kuò)增[9]、質(zhì)粒構(gòu)建、菌株鑒定[10-11]、分子診斷[12-13]等。菌落PCR方法只需要少量的菌細(xì)胞，不需要使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板，既方便又經(jīng)濟(jì)，已經(jīng)被廣泛用于細(xì)菌[14-15]、真菌[16-17]和微藻[7]的鑒定。H.pylori生長緩慢，通常需要3～5 d才能形成典型的針尖狀菌落，使用常規(guī)菌落PCR方法擴(kuò)增H.pylori基因，其效率低、不穩(wěn)定、重復(fù)性差。因此，為了提高H.pylori菌落PCR的擴(kuò)增效率，本研究選擇H.pylori大小不同的8種基因進(jìn)行菌落PCR優(yōu)化，擬在常規(guī)菌落PCR的基礎(chǔ)上開發(fā)一種快速、高通量、經(jīng)濟(jì)且具有良好重復(fù)性的分子診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、試劑及引物H.pyloriATCC 26695由山東大學(xué)病原生物學(xué)研究所饋贈，貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室傳代保存。無菌新鮮脫纖維綿羊血由鼎國生物技術(shù)有限公司代購，腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar，BHI)、H.pylori選擇性添加劑購自英國OXOID公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，2×Taq PCR Master MIX購自北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖購自生工生物(上海)有限公司]，8對引物[16SrDNA[18]、cagA-U(細(xì)胞毒素蛋白基因A[19]的上游片段)、cagA-D(細(xì)胞毒素蛋白基因A的下游片段)、iceA[20- 21](表皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)基因A)、ureA[22-23](編碼尿素酶亞基基因A)、hetA(鞭毛合成相關(guān)基因)、ropN[24](σ54轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)和Hp0792(Fis家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)]由生工生物(上海)有限公司合成，見表1。

表1 8種基因引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(日本，BIO-Rad 10213型)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器制造廠, DYY-8C型)，凝膠成像分析儀(北京市六一儀器制造廠，WD-9413B型)，臺式高速離心機(jī)(上海安亭，TGL-16B)，超純水機(jī)(成都艾柯，DZG-303A)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori26695的培養(yǎng) 接種H.pylori26695于BHI血瓊脂平板(含10%無菌脫纖維綿羊血)，37 ℃微需氧條件(10% CO2、5% O2、85% N2)培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2細(xì)菌基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增 用接種環(huán)刮取培養(yǎng)2～3 d的H.pylori的菌落于去離子水100 μL中，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒步驟制備基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 0.5 μL，2×Taq PCR Master MIX(12.5 μL)，正向和反向引物(各1.25 μL)，去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退失30 s、72 ℃延伸1 min 30個循環(huán)；最后72 °C終延伸5 min。

1.2.3菌落PCR反應(yīng)的優(yōu)化 (1)將去離子水(10 μL)加入PCR管或96孔板中、使用無菌接種針或牙簽從血瓊脂平板上挑取培養(yǎng)2～3 d的單菌落、并重懸于去離子水中，(2)將PCR管或96孔板(含有10 μL幽門螺桿菌懸浮液)置于沸水中煮沸10 s，(3)將PCR管或96孔板快速轉(zhuǎn)移至冰上冷凍5 min，(4)將正向和反向引物(各1.25 μL)及2×Taq PCR Master MIX(12.5 μL)加入到PCR管或96孔板中、總反應(yīng)體積為25 μL，(5)混勻后按基因組DNA的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，(6)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。步驟如圖1。

2 結(jié)果

如圖1所示，PCR擴(kuò)增幽門螺桿菌的8個基因均未顯示清晰條帶，陽性對照組(基因組DNA作為模板，泳道2)顯示單一清晰條帶，試驗組(菌落經(jīng)煮沸裂解速凍作為模板，泳道3～6)條帶與陽性對照組一樣顯示單一透明條帶。

注：M為Trans2K Plus II DNA Marker，泳道1為陰性對照(菌落未經(jīng)任何處理)，泳道2為陽性對照 (基因組DNA作為模板)，泳道3～6為試驗組(菌落經(jīng)煮沸冷凍作為模板)圖1 菌落PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR products for colony PCR amplification

3 討論

菌落PCR可從大量轉(zhuǎn)化子或平板樣本中方便、快速獲得目標(biāo)基因，是一種常規(guī)分子診斷技術(shù)。對于決大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌)，PCR過程中的預(yù)變性步驟可以快速破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使細(xì)菌染色體釋放到胞外，從而可用于PCR擴(kuò)增的模板；對于多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌)，雖然其細(xì)胞壁較厚，有多層肽聚糖組成，但PCR過程中預(yù)變性的高溫條件仍然足以破壞其細(xì)胞壁，其染色體釋放到胞外用于PCR擴(kuò)增的模板[25]。然而，對于多數(shù)真菌(細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)、殼多糖等)和放線菌，因其特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或生長特性，利用常規(guī)菌落PCR方法進(jìn)行分子鑒定仍存在一定的困難，需要對常規(guī)菌落PCR方法進(jìn)行特定改造或優(yōu)化[26]。

盡管H.pylori屬于常規(guī)的革蘭氏陰性細(xì)菌，然而，常規(guī)菌落PCR方法在H.pylori中應(yīng)用時效果不明顯、穩(wěn)定性較差，這可能與H.pylori的特殊生長環(huán)境(強(qiáng)酸環(huán)境)或特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)[27-28]，其具體原因尚不清楚。在本研究中，我們隨機(jī)選擇8個大小不同的基因，利用常規(guī)菌落PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，不能獲得擴(kuò)增條帶，盡管在陰性對照組中可以看到一些基因(例如ropN或16SrDNA)的模糊擴(kuò)增條帶，但亮度較弱不能用于進(jìn)一步分析。而將H.pylori菌落進(jìn)行煮沸裂解速凍后作為PCR模板，均可顯示出與陽性對照組相似的清晰條帶，表明煮沸裂解速凍法可以應(yīng)用于H.pylori的菌落PCR擴(kuò)增。

綜上所述，本研究優(yōu)化的菌落PCR技術(shù)對于H.pylori的鑒定效果較好，有助于快速進(jìn)行H.pylori的高通量分類，轉(zhuǎn)化體篩選和分子診斷。