陳相好， 蔡夢迪， 陳崢宏,2， 谷俊瑩， 文學(xué)琴， 洪偉， 崔古貞,2**

(1.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004)

艱難梭菌是一種產(chǎn)芽孢、革蘭陽性厭氧梭菌，在土壤、水以及哺乳動(dòng)物腸道等環(huán)境中廣泛分布[1]，是引起抗生素相關(guān)腹瀉、假膜性結(jié)腸炎的主要腸道病原體[1-3]。近年來，由于高致病性產(chǎn)毒菌株的出現(xiàn)(如ClostridiumdifficileBI/NAP1/027等)，艱難梭菌感染率持續(xù)增高[4-5]。研究表明，艱難梭菌株毒力與多種因素有關(guān)，包括TcdA、TcdB和ADP-核糖基化二元毒素；此外，黏附素Cwp66、鞭毛、纖維粘連FbpA、表面層蛋白SlpA等也參與了艱難梭菌的定植過程[6-8]，但是對其他毒力、定殖因子以及調(diào)控其產(chǎn)生的分子機(jī)制缺乏深入了解。sigma因子與RNA聚合酶核酶協(xié)同作用，協(xié)助RNA聚合酶識(shí)別DNA靶位點(diǎn)的啟動(dòng)子序列，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。在艱難梭菌中，有多個(gè)sigma因子參與多種代謝反應(yīng)，可對多種環(huán)境變化做出應(yīng)激反應(yīng)，如饑餓、氧刺激、酸堿度、滲透壓、乙醇、抗生素、溫度、膽汁酸等，這些因素幫助細(xì)菌適應(yīng)不同的環(huán)境[10-14]。sigB基因(Gene ID:4916093)編碼的sigma-B因子是一種重要的全局調(diào)控因子，其活性受到嚴(yán)格的調(diào)控；sigB基因與rsbV(Gene ID:4916091)、rsbW(Gene ID:4916092)基因位于一個(gè)基因簇，前后依次相鄰；rsbW(anti-sigma)與rsbV(anti-anti-sigma)和sigB(sigma-B)基因共同作用，調(diào)控sigma-B因子與RNA核心酶的結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[10]。CRISPR-Cas9技術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)菌遺傳改造的基因編輯技術(shù)，在艱難梭菌的其他因子得到成功應(yīng)用[15-16]。為了研究艱難梭菌sigma-B因子的功能，本研究嘗試構(gòu)建rsbV、rsbW及sigB基因的CRISPR-Cas9敲除載體，為研究sigma-B因子在艱難梭菌毒力中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 大腸桿菌DH5α購自Takara公司，艱難梭菌(Clostridiumdifficile630，CD630)及拜氏梭菌(ClostridiumbeijerinckiiNCIMB 8052, Cbei)由美國奧本大學(xué)Wang Yi教授饋贈(zèng)。

1.1.2試劑和儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根公司，蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉、瓊脂糖、腦心浸液瓊脂(BHI)、Goldview I型核酸染料購自北京索萊寶公司，8000 Marker、2×Taq Master Mix、Trans Start FastPfu DNA polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。儀器為SimpliAmpTM Thermal Cycler PCR儀、DYY-7C型電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析儀、BTH-100雙控溫干式恒溫儀。

1.2 方法

1.2.1菌株培養(yǎng) 大腸桿菌DH5α在LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，需要時(shí)加入30 mg/L的氯霉素；艱難梭菌在BHIS培養(yǎng)基于厭氧管中37 ℃培養(yǎng)(BHIS培養(yǎng)基為BHI加入5 g/L的酵母膏和0.1%的L-半胱氨酸)[15]。

1.2.2敲除載體引物的設(shè)計(jì)及構(gòu)建質(zhì)粒 利用基于Python語言設(shè)計(jì)的程序[17]，檢索rsbV、rsbW和sigB基因的潛在打靶位點(diǎn)，并獲得擴(kuò)增gRNA及同源臂的引物序列(表1)。本研究所構(gòu)建的質(zhì)粒特征及來源見表2。

1.2.3敲除載體的構(gòu)建 (1)利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取拜氏梭菌Cbei基因組，以gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物，Cbei基因組為模板進(jìn)行g(shù)RNA序列的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收特異性條帶。由于識(shí)別艱難梭菌CD630相應(yīng)DNA靶位點(diǎn)的特異性序列已設(shè)計(jì)在相應(yīng)的gRNA引物中(gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB)，因此以拜氏梭菌Cbei為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的主要目的是獲得其內(nèi)源性啟動(dòng)子用于gRNA的轉(zhuǎn)錄。利用BtgZI限制性內(nèi)切酶酶切pJZ23、PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用克隆試劑盒與擴(kuò)增的gRNA序列進(jìn)行無縫組裝，50 ℃反應(yīng)15 min，通過轉(zhuǎn)化及菌落PCR獲得質(zhì)粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB。(2)使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取艱難梭菌CD630基因組，并以其為模板，以rsbV-UF/rsbV-UR、rsbV-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR為引物分別擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的上游同源臂，再以rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，瓊脂糖DNA回收試劑盒回收特異性條帶。(3)以rsbV、rsbW、sigB基因的上下游同源臂為模板，rsbV-UF/ rsbV-DR、rsbW-UF/rsbW-DR、sigB-UF/sigB-DR為引物進(jìn)行重疊延伸PCR，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，瓊脂糖DNA回收試劑盒回收特異性條帶，與經(jīng)過NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進(jìn)行無縫組裝，通過菌落PCR鑒定得到敲除載體prsbV、prsbW、psigB。

表1 gRNA及同源臂的引物序列Tab.1 gRNA sequences and primer sequences

表2 本研究所構(gòu)建質(zhì)粒的特征及來源Tab.2 The features and sources of constructed plasmids

1.2.4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 取無縫組裝的連接產(chǎn)物2 μL轉(zhuǎn)入50 μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30 min，42 ℃熱激1 min，冰上冷卻5 min后加入LB液體培養(yǎng)基900 μL，于37 ℃ 180 r/min復(fù)蘇1 h，離心后取細(xì)胞沉淀涂布于LB固體培養(yǎng)基平板(含30 mg/L 氯霉素)，37 ℃過夜培養(yǎng)，菌落PCR進(jìn)行鑒定獲得質(zhì)粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB、prsbV、prsbW、psigB。

1.2.5敲除載體的驗(yàn)證 以獲得的敲除載體prsbV、prsbW、psigB為模板，通過PCR及測序進(jìn)一步驗(yàn)證所構(gòu)建的質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 gRNA序列及同源臂的擴(kuò)增

利用提取的拜氏梭菌Cbei基因組為模板，以設(shè)計(jì)的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進(jìn)行PCR，如圖1A所示的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明成功擴(kuò)增獲得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艱難梭菌CD630基因組為模板，以設(shè)計(jì)的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR引物分別擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，如圖2B所示的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以獲得的上下游同源臂PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，如圖3C所示的結(jié)果表明，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。

注：M為8 000 Marker，A中泳道1～3分別為gRNA-rsbV、gRNA-rsbW及gRNA-sigB，B中泳道1～2為rsbV基因0.6 kb 上游同源臂、泳道2為rsbV基因0.55 kb下游同源臂、泳道3為rsbW基因0.62 kb上游同源臂、泳道4為rsbW基因 0.55 kb下游同源臂、泳道5為sigB基因0.64 kb上游同源臂、泳道6為sigB基因的0.63 kb下游同源臂；C中泳 道1為rsbV基因1.1 kb同源臂、泳道2為rsbW基因1.1 kb同源臂、泳道3為sigB基因1.2 kb同源臂圖1 敲除載體gRNA序列及同源臂的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of gRNAs against rsbV，rsbW and sigB and homologous arms

2.2 敲除載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

將擴(kuò)增獲得的gRNA序列與BtgZI酶切的pJZ23質(zhì)粒通過克隆試劑盒進(jìn)行無縫組裝，通過菌落PCR驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，再將擴(kuò)增獲得的同源臂與NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進(jìn)行無縫組裝，通過菌落PCR驗(yàn)證，獲得敲除載體prsbV、prsbW、psigB。圖2A為以提取的質(zhì)粒prsbV、prsbW、psigB為模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進(jìn)行PCR，結(jié)合測序結(jié)果，證實(shí)成功構(gòu)建了敲除載體的gRNA序列；圖2B同樣以prsbV、prsbW、psigB為模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物分別擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分別成功擴(kuò)增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通過與上游同源臂融合后再連接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB載體上的，因此本研究成功構(gòu)建了敲除載體的上下游同源臂，測序結(jié)果也證實(shí)rsbV、rsbW、sigB三個(gè)基因的上下游同源臂均構(gòu)建成功。

3 討論

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌及古細(xì)菌在發(fā)展進(jìn)化的過程中抵御外來侵害而建立起來的適應(yīng)性自身免疫防御系統(tǒng)，基于此原理建立起來的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，屬于Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)，該技術(shù)相比以前的鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技術(shù)，具有方便、簡捷及編輯效率高的優(yōu)點(diǎn)[18]，被廣泛應(yīng)用于多種原核生物及真核生物的遺傳改造，為相關(guān)生物的功能及機(jī)制等研究提供了技術(shù)保障，展現(xiàn)了非常廣闊的應(yīng)用前景和潛力。由于抗生素的大量使用及艱難梭菌高毒力株的出現(xiàn)，使得艱難梭菌感染引起的嚴(yán)重程度、耐藥率、復(fù)發(fā)率均呈上升趨勢[19]。探究艱難梭菌的毒力因子、致病和耐藥機(jī)制及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制等，有利于加深對艱難梭菌的認(rèn)識(shí)，為艱難梭菌的防治提供基礎(chǔ)。

注：M為8 000 Marker，A中泳道1為gRNA-rsbV、泳道2為gRNA-rsbW、泳道3為gRNA-sigB，B中泳道1為rsbV 基因0.55 kb下游同源臂、泳道2為rsbW基因0.55 kb下游同源臂、泳道3為sigB基因的0.63 kb 下游同源臂，C為本研究所構(gòu)建的敲除載體模式圖圖2 敲除載體的驗(yàn)證Fig.2 Verification of constructed knockout vectors

本研究以艱難梭菌中sigB相關(guān)基因(rsbV、rsbW和sigB)為靶點(diǎn)，利用提取的拜氏梭菌Cbei基因組為模板，以設(shè)計(jì)的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進(jìn)行PCR，成功擴(kuò)增獲得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艱難梭菌CD630基因組為模板，以設(shè)計(jì)的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/sigB-DR引物分別擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以獲得的上下游同源臂PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。本研究再將擴(kuò)增獲得的gRNA序列與BtgZI酶切的pJZ23質(zhì)粒通過克隆試劑盒進(jìn)行無縫組裝，通過菌落PCR驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，將擴(kuò)增獲得的同源臂與NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進(jìn)行無縫組裝，通過菌落PCR驗(yàn)證，獲得敲除載體prsbV、prsbW、psigB。以提取的質(zhì)粒prsbV、prsbW、psigB為模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進(jìn)行PCR，結(jié)合測序結(jié)果也證實(shí)成功構(gòu)建了敲除載體的gRNA序列；同樣以prsbV、prsbW、psigB為模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物分別擴(kuò)增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分別成功擴(kuò)增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通過與上游同源臂融合后再連接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB載體上的。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建rsbV、rsbW、sigB三個(gè)基因的CRISPR-Cas9敲除載體，為后續(xù)突變株的構(gòu)建及其功能研究奠定了基礎(chǔ)。