熊 凱, 陳 建, 傅慶洋

熊凱, 傅慶洋, 義烏市中心醫(yī)院急診科 浙江省義烏市 322000

陳建, 義烏市中心醫(yī)院胃腸外科 浙江省義烏市 322000

核心提要： miR-7在雨蛙素構(gòu)建的急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)模型細胞中高表達, miR-7靶向負調(diào)控特異性蛋白3(specific protein 3, Sp3), 敲減miR-7表達可以通過上調(diào)Sp3抑制AP腺泡細胞凋亡.

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是臨床上常見的一種急腹癥, 其發(fā)病率呈逐年上升趨勢, 死亡率也一直較高[1].AP的致病因素很多, 發(fā)病機制尚未完全清楚, 有研究發(fā)現(xiàn)腺泡細胞凋亡和AP的嚴重程度呈負相關, 可以通過促進腺泡細胞的凋亡減輕AP的嚴重程度[2]. 抑制GRP78可以促進胰腺腺泡細胞凋亡, 減輕雨蛙素誘導的胰腺炎癥的嚴重程度[3]. miR-7是miRNA家族的成員之一, 不僅參與多種組織器官的發(fā)育, 且與臨床相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]. miR-7在胃炎組織中miR-7低表達, 下調(diào)其表達可促進細胞增殖, 引起炎癥促使癌癥發(fā)生[5]. 上調(diào)miR-7的表達能抑制人胰腺癌AsPC-1和BxPC-3細胞增殖和侵襲能力, 促進細胞凋亡[6]. miR-7在小鼠急性肺損傷模型中上調(diào)表達, 通過調(diào)控KLF4可以改善急性肺損傷[7]. miR-7在腎癌組織中高表達, 可作為腎癌早期診斷、治療乃至預后判斷的新的生物標記物[8]. mmiR-7在口腔鱗狀細胞癌中低表達, 與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程高度相關[9]. 此外miRNA也與AP的診斷和預后相關[10]. 研究發(fā)現(xiàn)miR-494在AP條件下表達升高, 可以抑制胰腺腺泡細胞凋亡[11]. miR-216a在AP中高表達, 可作為生物標記物用來早期診斷[12]. 而miR-7在AP中的研究較少, 基于此,本實驗旨在研究miR-7對AP腺泡細胞增殖和凋亡的影響及相關機制, 為AP的早期診斷、治療和預后提供新靶點和臨床依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠胰腺腺泡AR42J購自中國科學院上海細胞庫. 雨蛙素購自美國Sigma公司; 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司; RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒購自日本Takara公司; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司; Western Blot試劑盒購自上海信裕生物技術(shù)有限公司; BCA試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所; LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司; 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司; 細胞板、流式細胞儀購自賽默飛公司; 載體質(zhì)粒均由金瑞斯生物科技公司構(gòu)建.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及AP建模: 大鼠胰腺腺泡AR42J細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基, 置于37 ℃,含5%CO2恒溫箱培養(yǎng). 每2-3 d傳代一次. 造模前一天取AR42J細胞接種于6孔板上, 培養(yǎng)24 h后加入15 nmol/L的雨蛙素, 震蕩混勻后繼續(xù)培養(yǎng), 取0 h、4 h、8 h、12 h、24 h時間點的細胞, 收集備用.

1.2.2 細胞分組和轉(zhuǎn)染: 取常規(guī)培養(yǎng)的大鼠胰腺腺泡AR42J細胞消化后接種于96孔板中, 待細胞生長至80%融合進行相關實驗, 分為NC組、Cerulein組(添加15 nmol/L雨蛙素)、miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-7組(轉(zhuǎn)染miR-7 mimics)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con組)、anti-miR-7組(轉(zhuǎn)染anti-miR-7).

取造模成功的AR42J細胞消化后接種于96孔板中,待細胞生長至80%融合, 更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h, 隨后進行轉(zhuǎn)染. 轉(zhuǎn)染分為轉(zhuǎn)染分為Cerulein+antimiR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、Cerulein+anti-miR-7組(轉(zhuǎn)染anti-miR-7)、Cerulein+pcDNA(轉(zhuǎn)染pcDNA)、Cerulein+pcDNA-特異性蛋白3(specific protein 3, Sp3)組(轉(zhuǎn)染pcDNA-Sp3 mimics)、anti-miR-7+si-con組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-7和si-con)、anti-miR-7+si-Sp3(共轉(zhuǎn)染antimiR-7和si-Sp3)組, 轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作.

1.2.3 ELISA法檢測淀粉酶(amylase, AMY)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的表達: 取雨蛙素處理后各個時間點的細胞, 離心取上清, 按ELISA試劑盒說明書進行檢測.

1.2.4 qRT-PCR分析miR-7和Sp3 mRNA表達水平: 按照Trizol說明書提取總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 按照AceQ qPCR SYBR?Green Mix說明書進行qRT-PCR方法擴增. 循環(huán)條件為95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s, 共40個循環(huán); 60 ℃延長5 min. 相對表達量采用2-△△Ct法計算.

1.2.5 Western Blot檢測Sp3蛋白表達: 提取各組細胞蛋白, 用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量. 各組蛋白上樣量60 μg, SDS-PAGE后, 經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上. 用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min, 分別加入相應的一抗, 4 ℃孵育過夜, PBS洗滌3次, 每次5 min; 再加入相對應的二抗室溫孵育2 h, PBS洗滌3次, 每次10 min, 后在暗室中曝光顯影, 再浸入定影, 最后洗去殘液晾干, 將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理, 測定各組蛋白條帶的吸光度, 以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達水平.

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡: 用不含EDTA的胰酶消化細胞, 離心收集各組細胞, PBS漂洗2次, 加結(jié)合緩沖液重懸細胞. 依據(jù)試劑盒說明書, 先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育. 流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長530 nm處的熒光強度. 實驗重復3次.

1.2.7 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-7對Sp3的靶向調(diào)控: TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示Sp3 3′UTR區(qū)域有miR-7結(jié)合位點. 構(gòu)建野生型和突變型基因靶點Sp3的3′UTR-熒光素酶表達載體(WT-Sp3和MUT-Sp3), 取對數(shù)生長期大鼠胰腺腺泡AR42J細胞接種于24孔板(5×104個/孔),待細胞生長至80%融合時, 用LipofectamineTM2000將WT-Sp3和MUT-Sp3組細胞分別轉(zhuǎn)染miR-con和miR-7.依據(jù)說明書要求, 使用熒光素酶報告基因檢測儀進行雙熒光素酶報告實驗測定. 實驗結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進行統(tǒng)計學分析. 實驗重復3次.

統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.00進行統(tǒng)計學分析. 計量資料以mean±SD表示, 兩組比較行t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析, 以P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 檢測雨蛙素處理AMY, TNF-α和IL-6的表達 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測結(jié)果(圖1)顯示, 與0 h相比, 雨蛙素處理4 h、8 h、12 h、24 h后AMY、TNF-α、IL-6的表達均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 且均在8 h時達到最大.

2.2 雨蛙素處理AR42J后miR-7和Sp3的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果(圖2A和B)顯示, 雨蛙素處理AR42J后miR-7的表達水平顯著升高, Sp3 mRNA的表達水平顯著下降(P＜0.01). Western Blot檢測結(jié)果(圖2C和D)顯示, 與對照組相比, 雨蛙素處理后Sp3蛋白的表達水平顯著下降(P＜0.01). 可見, 雨蛙素處理AR42J促進miR-7的表達, 抑制Sp3的表達.

2.3 敲減miR-7對雨蛙素處理AR42J細胞凋亡的影響qRT-PCR檢測結(jié)果(圖3A)顯示, 雨蛙素處理AR42J后miR-7的表達水平顯著升高, 相較于Cerulein+anti-miR-con組, Cerulein+anti-miR-7組miR-7的表達水平顯著下降(P＜0.05). 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖3B)顯示, 雨蛙素處理AR42J后細胞凋亡率顯著升高, Cerulein+anti-miR-7組于Cerulein+anti-miR-con組, AR42J細胞的凋亡率顯著降低(P＜0.01). 可見, 敲減miR-7可以抑制雨蛙素處理AR42J細胞凋亡.

2.4 miR-7靶向Sp3 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測到Sp3與miR-7存在結(jié)合位點(圖4A). 熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果(圖4B)顯示, 轉(zhuǎn)染野生型Sp3基因表達載體WTSp3后, 相較于miR-con組, miR-7組AR42J細胞的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.01); 而轉(zhuǎn)染突變型Sp3基因表達載體MUT-Sp3后, 相較于miR-con組, miR-7組AR42J細胞的熒光素酶活性差異不顯著. Western Blot檢測結(jié)果(圖4C)顯示, 相較于miR-con組, miR-7組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著降低; 而相較于anti-miR-con組,anti-miR-7組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著升高(P＜0.01). 可見, miR-7可以靶向調(diào)控Sp3.

2.5 過表達Sp3抑制雨蛙素處理AR42J細胞凋亡 Western Blot檢測結(jié)果(圖5A)顯示, 相較于NC組, Cerulein組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著降低; 相較于Cerulein+pcDNA組, Cerulein+pcDNA-Sp3組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著升高(P ＜0.01). 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖5B)顯示, 相較于NC組, Cerulein組AR42J細胞凋亡率顯著升高; 相較于Cerulein+pcDNA組, Cerulein+pcDNA-Sp3組AR42J細胞凋亡率顯著降低(P＜0.01). 可見, 過表達Sp3抑制雨蛙素處理AR42J細胞凋亡.

2.6 抑制Sp3表達逆轉(zhuǎn)敲減miR-7對雨蛙素處理AR42J細胞凋亡的影響 Western Blot檢測結(jié)果(圖6A)顯示, 雨蛙素處理AR42J細胞后, 相較于anti-miR-con組, anti-miR-7組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著升高; 相較于antimiR-7+si-con組, anti-miR-7+si-Sp3組AR42J細胞中Sp3蛋白的表達水平顯著降低(P＜0.01). 流式細胞儀檢測結(jié)果(圖6B)顯示, 相較于anti-miR-con組, anti-miR-7組AR42J細胞凋亡率顯著降低; 相較于anti-miR-7+si-con組, antimiR-7+si-Sp3組AR42J細胞凋亡率顯著升高(P＜0.01).可見, 抑制Sp3表達可以逆轉(zhuǎn)敲減miR-7對雨蛙素處理AR42J細胞的抑制凋亡作用.

3 討論

AP是胰腺的急性炎癥性病變, 可分為輕癥、中度重癥和重癥三類, 越嚴重預后效果越差, 死亡率越高, 嚴重影響人類身體和生命健康[13]. 重癥AP常伴有休克、腹膜炎、敗血癥、腸道功能障礙、凝血功能異常、全身炎癥反應綜合征和多器官功能衰竭, 還會并發(fā)糖尿病等[14]. 近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA在AP中扮演著重要的角色, 參與AP的發(fā)生發(fā)展[15]. 如miR-9在AP中高表達[16]; 在急性水腫性胰腺炎中上調(diào)miR-92b表達, 胰腺腺泡細胞的凋亡率增加[17]; 下調(diào)miR-383的表達可以提高AP時細胞自噬水平[18]; miR-21在AP腺泡細胞中低表達, 抑制其表達可抑制雨蛙素誘導的細胞凋亡, 進而加重胰腺炎的發(fā)展[19]. 而miR-7在AP病人中高表達, 可作為AP病變的診斷和預后生物標志物[20]. 本研究結(jié)果顯示, 在雨蛙素處理后的AR42J細胞中miR-7的表達水平顯著升高, 而敲減miR-7抑制雨蛙素處理的AR42J細胞凋亡.

圖1 雨蛙素處理AR42J后AMY、TNF-α和IL-6表達的影響.

圖2 雨蛙素處理AR42J細胞后miR-7和Sp3的表達.

圖3 敲減miR-7抑制雨蛙素處理AR42J細胞誘導細胞凋亡.

圖4 miR-7靶向調(diào)控Sp3的表達.

Sp3是Sp蛋白家族中的一員, 多數(shù)情況下是轉(zhuǎn)錄抑制因子[21]. 研究發(fā)現(xiàn)Sp3通過調(diào)控其下游增殖相關的基因的表達調(diào)控腫瘤的增殖和凋亡[22]. 轉(zhuǎn)錄因子Sp3在肝癌[23]、胰腺癌[24]中高表達, 與腫瘤惡性程度和患者術(shù)后復發(fā)率相關. Sp3可以增強胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力[25]. Sp3在乳腺癌中高表達, 參與其發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉(zhuǎn)移過程[26]. Sp3可以抑制白血病細胞增殖、促進其凋亡及增強化療藥物的耐藥性[27]. miR-223通過靶向調(diào)控Sp3可促進ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1表達進而增強細胞膽固醇流出[28]. 而Sp3關于在胰腺炎中的作用極其機制的研究較少, 付強等[29]發(fā)現(xiàn)Sp3通過被miR-135a抑制其表達而促進大鼠AP中AR42J細胞的凋亡. 本研究的結(jié)果顯示, 雨蛙素處理AR42J后Sp3的表達水平顯著下降, 過表達Sp3可以抑制雨蛙素處理AR42J細胞凋亡.miR-7靶向負調(diào)控Sp3, 抑制Sp3表達可以逆轉(zhuǎn)敲減miR-7對雨蛙素處理AR42J細胞的抑制凋亡作用.

總之, miR-7可通過靶向調(diào)控SP3影響AP腺泡細胞的凋亡. 研究miR-7在AP發(fā)病機制中的作用及臨床價值,為診斷和治療AP提供新靶點和新思路.

文章亮點

實驗背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)病因較多且機制較為復雜, 并發(fā)癥較多, 根據(jù)其嚴重程度主要分為輕型AP和重癥AP. 輕型經(jīng)治療后恢復較好, 但重癥AP早期癥狀不典型, 且發(fā)展迅速, 后期惡化嚴重可導致多器官功能衰竭, 致死率高. 早診斷重癥AP, 及時治療, 提高治愈率是現(xiàn)階段臨床工作的重點. 我國目前AP主要病因膽道疾病, 高脂血癥, 過度酒精, 暴飲暴食等. 治療方式有內(nèi)科治療和手術(shù)治療. 而要準確、恰當、及時的治療需要對其機制更為了解, 腺泡細胞死亡方式是AP的研究的一個重點, 主要包括凋亡、壞死、程序性凋亡、自噬和焦亡等, 部分研究證明腺泡細胞死亡方式影響AP病情轉(zhuǎn)歸, 凋亡能減輕炎癥反應, 而壞死加重炎癥反應. 而本文主要是從miRNA方面研究其對AP凋亡的影響及其可能的作用機制. 從一個更小的分子層面進行研究以期為以后的臨床治療提供理論基礎和依據(jù).

由于對文化建設的重要性認識不到位和資金投入不足等原因，在經(jīng)濟社會發(fā)展過程中文化建設往往都具有滯后性，而且主要是從場館設施、機構(gòu)設置、隊伍建設、演藝院線、活動組織、文化下鄉(xiāng)等方面針對問題和不足而進行的“補課”，表現(xiàn)出哪有問題就抓哪里、哪里有不足就補哪里。隨著黨對文化建設的不斷重視，特別是在黨的十八大召開之后為貫徹落實黨的十八大精神，廣州的文化建設又邁出了新的步伐，開始進入由“文化補課”轉(zhuǎn)向“文化驅(qū)動”的發(fā)展提升期。

圖6 敲減miR-7和抑制Sp3表達對雨蛙素處理AR42J細胞凋亡的影響.

實驗動機

本研究的主題是miRNA-7對AP增殖凋亡的影響, 擬解決的關鍵問題是了解miRNA-7是如何影響AP細胞的增殖和凋亡, 以及其和特異性蛋白3(specific protein 3, Sp3)之間的關系及他們對AP的影響, 拓展AP的發(fā)生發(fā)展機制, 為以后臨床上的診斷治療等提供新思路和依據(jù).

實驗目標

研究的主要目標即miRNA-7, Sp3, AP之間的聯(lián)系, 研究得到miRNA-7和Sp3均在AP中異常表達, 敲減miRNA-7和過表達Sp3均可抑制雨蛙素處理AR42J細胞凋亡, 且miR-7靶向負調(diào)控Sp3. 可以從調(diào)控AP凋亡的途徑來調(diào)控其進展, 為其治療提供新思路.

實驗方法

本研究首先是用雨蛙素處理大鼠胰腺腺泡來構(gòu)建AP的模型, 通過ELISA法檢測淀粉酶(amylase, AMY)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的水平變化檢驗模型構(gòu)建成功.轉(zhuǎn)染miRNA-7和Sp3的過表達和抑制表達載體質(zhì)粒, 通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡, Western blot檢測Sp3蛋白表達, qRT-PCR檢測miRNA-7和Sp3 mRNA表達水平, 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-7與Sp3之間的靶向關系.

實驗結(jié)果

本實驗的結(jié)果是在雨蛙素構(gòu)建的A P模型細胞中,miR-7的表達水平顯著升高; Sp3的表達水平顯著降低(P＜0.01). 敲減miR-7、過表達Sp3腺泡細胞凋亡率降低.miR-7靶向負調(diào)控Sp3; 抑制Sp3表達逆轉(zhuǎn)了敲減miR-7對雨蛙素處理AR42J細胞的凋亡抑制作用. 達到了本實驗的目的, 對該領域AP的發(fā)病進展機制又多了一份理論依據(jù). 以后可以進一步從臨床方面進行應用.

實驗結(jié)論

miR-7靶向負調(diào)控Sp3; 敲減miR-7、過表達Sp3抑制腺泡細胞凋亡. 可以通過調(diào)控miR-7影響AP的進展. 從miRNA角度去研究其對AP的影響拓寬了研究的范圍,可更深層次多角度的去了解AP.

展望前景

本研究僅是在實驗的小鼠上進行研究, 有一定的局限性, 僅限于理論層面, 對于到人的影響還有一定的距離.本研究未來研究的方向是進一步深入的研究調(diào)控miR-7和Sp3對治療AP小鼠的影響及其可能會產(chǎn)生的現(xiàn)象等.最佳方法是尋找更接近于真實AP的小鼠或者與人AP更為相似的受體.