朱 艷, 劉瑋麗, 吳明東, 莊永衛(wèi), 葉淑芳, 施旭紅

朱艷, 吳明東, 莊永衛(wèi), 葉淑芳, 施旭紅, 麗水市人民醫(yī)院全科 浙江省麗水市 323000

劉瑋麗, 邵逸夫醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310000

核心提要： 鉑類藥物為主的化療是治療胃癌的常用手段之一, 而化療耐藥制約著化療的最終療效. 本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)SGC-7901/DDP細胞miR-214表達后, 順鉑耐藥性、細胞遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均降低; 同時, NF-κB與Bcl-2的表達也明顯降低.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 據(jù)2018年腫瘤年報顯示, 我國GC發(fā)病率位于所有惡性腫瘤中的第五位, 死亡率位于所有惡性腫瘤中的第三位[1]. 且, 隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化, 以及現(xiàn)代生活壓力的增加, GC的發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化趨勢[2]. GC常規(guī)治療手段是化療或者GC切除術(shù)后輔以化療方式[3]. 雖然大部分GC患者對化療呈現(xiàn)出較好的初始反應(yīng), 但很快就易出現(xiàn)獲得性耐藥, 而再次化療效果極不理想[4]. 即便是化療敏感的GC患者也易進展為化療耐藥性GC患者; 而這種獲得性耐藥往往是多藥耐藥, 對其他具有不同分子結(jié)構(gòu)和作用靶點的抗腫瘤藥物也往往存在交叉性耐藥, 此時更換或聯(lián)合其他種類化療藥物也難以使患者獲益[5].因此, 逆轉(zhuǎn)GC細胞對化療的耐藥性的研究, 不僅是急需解決的臨床治療課題, 還具有重大的社會意義.

在腫瘤的研究中, 許多與GC化療藥物敏感性的靶點受到miRNAs的調(diào)控[6]. miR-214作為miRNAs中的一員, 不但被報道可以調(diào)節(jié)包含GC細胞在內(nèi)的多種癌細胞的增殖、侵襲和遷移[7,8]; 而且miR-214表達還與骨肉瘤、卵巢癌和舌鱗狀細胞癌等癌細胞的順鉑耐藥性相關(guān)[9-11]. 盡管miR-214已被證明在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有調(diào)控功能, 但其對GC順鉑耐藥中的具體作用尚不清楚. 本研究討論敲低miR-214對GC順鉑耐藥株SGC-7901/DDP的耐藥性、遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影響, 并討論其可能的初步機制.

1 材料和方法

1.1 材料 人GC順鉑耐藥SGC-7901/DDP細胞購自中國科學(xué)院上海生物細胞研究所; 胎牛血清購自美國Gibco公司; RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司; CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司; E-cadherin(E-cad)抗體購自美國Acam公司; Vimentin、NF-κB和Bcl-2抗體均購自美國Santa Cruz公司; N-cadherin (N-cad)抗體購自美國BD公司; miR-214 NC和miR-214 inhibitor由上海吉瑪公司合成; 其他試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染: 將人GC順鉑耐藥SGC-7901/DDP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中, 在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 待細胞融合至80%-90%時, 按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染, 實驗共分為三組: 對照組(Control), 陰性對照組(miR-214 NC)和miRNA-214下調(diào)組(miR-214 inhibitor),陰性對照組與沉默組分別轉(zhuǎn)染miR-214 NC與miR-214 inhibitor, 48 h后更換培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)細胞, 備用.

1.2.2 細胞存活率檢測: 嚴格按照CCK-8試劑盒說明書操作, 將SGC-7901/DDP細胞和已轉(zhuǎn)染miR-214 NC與miR-214 inhibitor的SGC-7901/DDP細胞按照5×104的密度接種到96孔板中, 分別加入終濃度分別為50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L的順鉑, 分別再繼續(xù)培養(yǎng)24 h與48 h. 達到時間終點時, 每孔加入10 μL CCK-8溶液, 在培養(yǎng)箱中孵育2 h, 用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度(OD值). 計算細胞存活率, 細胞存活率=處理組OD/對照組OD值×100%.

1.2.3 細胞遷移能力: 收集SGC-7901/DDP細胞和已轉(zhuǎn)染miR-214 NC與miR-214 inhibitor的SGC-7901/DDP細胞,將其接種至6孔板, 待細胞達到單細胞層完全融合時, 采用無菌10 μL槍頭劃痕, 并采用無菌生理鹽水沖洗細胞2次, 然后置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h和24 h. 導(dǎo)致顯微鏡拍照記錄細胞在劃痕開始時和劃痕后12 h與24 h的細胞圖像, 采用IPP軟件計算細胞遷移面積.

1.2.4 免疫印跡法: 收集SGC-7901/DDP細胞和已轉(zhuǎn)染miR-214 NC與miR-214 inhibitor的SGC-7901/DDP細胞,然后分別加入預(yù)冷的細胞裂解液, 4 ℃下12000×g離心15 min, 收集上清液. BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白濃度測定后, 取50 μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液一起進行SDS-PAGE電泳, 然后再電轉(zhuǎn)至合適大小的PVDF膜, 加入5%脫脂牛奶, 室溫下封閉1 h, 加入一抗稀釋液,室溫下?lián)u床孵育1 h, 4 ℃孵育過夜, TBST漂洗5 min×3次, 加入相應(yīng)二抗, 37 ℃孵育1 h, TBST洗滌5 min×3次,采用ECL電化學(xué)發(fā)光顯色, 采用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析, 計量資料采用mean±SD表示, 多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析后LSD-t檢驗, 以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)miR-214降低SGC-7901/DDP細胞對順鉑耐藥性 CCK-8法結(jié)果(圖1)顯示, 與Control組或miR-214 NC組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor 24 h(圖1A)或48 h(圖1B)后, SGC-7901/DDP細胞對順鉑的耐藥性均降低, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05). 其中與Control組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 NC 24 h(圖1A)或48 h(圖1B)后, SGC-7901/DDP細胞對順鉑的耐藥性無影響, 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05).

2.2 下調(diào)miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞遷移 劃痕試驗結(jié)果(圖2)顯示, 與Control組或miR-214 NC組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor后, SGC-7901/DDP細胞遷移面積明顯降低, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05). 其中與Control組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 NC后, SGC-7901/DDP細胞遷移面積無明顯變化, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05).

2.3 下調(diào)miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞EMT Western blot結(jié)果顯示(圖3), 與Control組或miR-214 NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor后, SGC-7901/DDP細胞中E-cad蛋白表達顯著上升(P＜0.05), Vimentin與N-cad蛋白表達均顯著下降(均P＜0.05); 其中與Control組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 NC后, 上述相關(guān)蛋白均無顯著變化(均P＞0.05).

2.4 下調(diào)miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞中NF-κB與Bcl-2蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示(圖4), 與Control組或miR-214 NC組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor后,SGC-7901/DDP細胞中NF-κB(圖4A)與Bcl-2(圖4B)的表達均明顯下調(diào), 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05). 其中與Control組相比, 轉(zhuǎn)染miR-214 NC后, SGC-7901/DDP細胞中NF-κB(圖4A)與Bcl-2(圖4B)的表達無明顯差異(均P＞0.05).

3 討論

GC以化療或者GC切除術(shù)后輔以基礎(chǔ)化療作為主要的治療手段[3]. 順鉑是常用的廣譜的腫瘤化療藥物之一,廣泛應(yīng)用于頭頸部腫瘤、GC、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等各類腫瘤的臨床治療. 但在臨床上, 大多數(shù)化療GC患者會出現(xiàn)順鉑耐藥, 而, 順鉑耐藥也是GC患者臨床治療失敗的主要原因[4,5]. 而miRNAs的差異表達在GC的順鉑化療耐藥中發(fā)揮重要作用[6,12]. 如miR-129在GC化療耐藥組織中低表達; 而過表達miR-129后, GC細胞對順鉑的耐藥性得到逆轉(zhuǎn), 造成對順鉑的敏感性明顯提高[12].miR-214作為總多miRNAs的一員, 參與調(diào)控骨肉瘤、卵巢癌和舌鱗狀細胞癌細胞的順鉑耐藥性[9-11]. 而在GC耐藥細胞中改變miR-214表達是否對順鉑耐藥產(chǎn)生影響尚不清楚. 本研究在GC順鉑耐藥細胞SGC-7901/DDP中通過轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor后, 發(fā)現(xiàn), 敲低miR-214表達能降低SGC-7901/DDP細胞對順鉑的耐藥性, 抑制細胞的遷移與EMT.

圖1 敲低miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞對順鉑耐藥性.

圖2 敲低miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞遷移.

圖3 敲低miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞EMT.

EMT是指細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程[12]. 在此過程中伴隨著上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達減少和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達增加, 以及間質(zhì)細胞標志物波形蛋白(Vimentin)增加等EMT的標志物的改變[13]. 多項研究表明[13,14], EMT在腫瘤的遷移與侵襲中發(fā)揮著重要的作用, 當(dāng)腫瘤細胞出現(xiàn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)化后, 失去細胞極性,降低與基底膜的連接性, 從而具有降解細胞外基質(zhì)、高遷移能力與侵襲能力的間質(zhì)表型; 而抑制EMT能抑制腫瘤細胞遷移. 本研究中, 發(fā)現(xiàn)敲低miR-214表達能降低SGC-7901/DDP細胞的遷移與敲低miR-214降低SGC-7901/DDP細胞EMT進程相關(guān).

圖4 敲低miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞中NF-κB與Bcl-2蛋白表達. n = 4, aP＜0.05, 與對照組或者miR-214 NC組相比.

NF-κB是一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子. 研究發(fā)現(xiàn), 在順鉑耐藥的腫瘤細胞中, NF-κB和Bcl-2高表達, 而抑制NF-κB和Bcl-2表達, 能夠使多種腫瘤細胞對化療藥物的敏感性增高[15,16]. 另外, 抑制NF-κB和Bcl-2表達能使GC細胞遷移與EMT降低[17]. Bcl-2的調(diào)節(jié)位點上有NF-κB的結(jié)合位點, 受NF-κB的調(diào)控, 與NF-κB具有協(xié)同作用[18].我們研究結(jié)果顯示, 下調(diào)miR-214表達后, SGC-7901/DDP細胞中的NF-κB與Bcl-2蛋白明顯降低, 提示敲低miR-214抑制SGC-7901/DDP細胞順鉑耐藥性可能與抑制NF-κB與Bcl-2蛋白表達相關(guān). 下調(diào)miR-214如何抑制NF-κB與Bcl-2表達, 還需要進一步進行研究驗證.

總之, 下調(diào)miR-214的表達能夠抑制GC順鉑耐藥株SGC-7901/DDP對順鉑的耐藥性, 同時使得細胞遷移能力下降, 并促進EMT作用, 可能與其抑制NF-κB與Bcl-2蛋白表達的作用有關(guān).

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer, GC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一. 而化療是治療GC常規(guī)治療手段之一. 而GC患者化療容易出現(xiàn)獲得性化療耐藥. 因此, 研究逆轉(zhuǎn)GC化療耐藥性的靶點和調(diào)控信號機制, 是當(dāng)今治療GC急需解決的重要的臨床課題.

實驗動機

在腫瘤的研究中, 許多miRNAs在調(diào)控腫瘤細胞的化療耐藥性中發(fā)揮著重要作用. miR-214作為總多miRNAs中的一員, 可以促進多種癌細胞包含GC細胞的增殖、侵襲和遷移, 另外, miR-214還參與調(diào)控骨肉瘤細胞、卵巢癌細胞和舌鱗狀細胞癌細胞對順鉑耐藥性的改變. 盡管miR-214已被證明在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有調(diào)控功能, 但其對GC順鉑耐藥中的具體作用尚不清楚.

實驗?zāi)繕?/p>

本研究采用GC順鉑耐藥SGC-7901/DDP細胞, 然后通過轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor, 下調(diào)miR-214表達后, 觀察SGC-7901/DDP細胞遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與順鉑耐藥性的變化, 并分析其初步作用機制.

實驗方法

SGC-7901/DDP細胞轉(zhuǎn)染miR-214 inhibitor后, 通過CCK8法評估敲低miR-214是否影響細胞對順鉑耐藥性; 通過劃痕實驗評估敲低miR-214是否影響細胞遷移能力; 免疫印跡法評估敲低miR-214是否影響細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物表達, 以及NF-κB與Bcl-2表達水平.

實驗結(jié)果

敲低miR-214后, SGC-7901/DDP細胞對順鉑耐藥性明顯降低; 敲低miR-214后, SGC-7901/DDP細胞遷移能力下降; 敲低miR-214后, SGC-7901/DDP細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物表達發(fā)生了改變, 表現(xiàn)為E-cad蛋白表達顯著上升, Vimentin與N-cad蛋白表達顯著下降; 同時, 敲低miR-214后, SGC-7901/DDP細胞NF-κB與Bcl-2的表達明顯降低.

實驗結(jié)論

敲低miR-214具有抑制SGC-7901/DDP細胞對順鉑耐藥性、細胞遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用. 而這種作用可能與下調(diào)NF-κB與Bcl-2的表達有關(guān).

展望前景

本研究提示, 下調(diào)miR-214能逆轉(zhuǎn)GCSGC-7901/DDP細胞對順鉑的耐藥性, 為GC順鉑耐藥提供了一定的研究靶點. 本研究下步將先檢查臨床樣本GC耐藥組織中miR-214表達, 并采用GC耐藥細胞建立GC移植荷瘤鼠在動物實驗上檢驗下調(diào)miR-214后, GC順鉑耐藥性是否發(fā)生逆轉(zhuǎn).