馮福梅, 張 磊

馮福梅, 張磊, 天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科 天津市 301800

核心提要： 本文通過分析Oncomie和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫Kruppel樣因子5(kruppel-like factor 5, KLF5)在胃癌(gastric cancer, GC)中的表達(dá)及其與患者預(yù)后相關(guān)性, 同時采用免疫組織化學(xué)方法證實(shí)KLF5在GC中高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后有關(guān), 提示KLF5可作為GC預(yù)后的潛在生物學(xué)分子標(biāo)記物.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是臨床上最為常見的消化道惡性腫瘤之一. 新近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示, 2019年北美GC新確診患者27510例, 而當(dāng)年死亡人數(shù)為1140例, GC已成為癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1]. 我國GC患者整體預(yù)后較差, 主要原因?yàn)榛颊叽_診時大多已發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的進(jìn)展期病變, 早期或超早期患者比例較少[2]. 近年來, 隨著診療水平的提高和相關(guān)藥物的研發(fā), GC患者的整體預(yù)后有望得到改善. GC患者預(yù)后的影響因素較多, 包括臨床分期、病理分級、術(shù)后輔助治療等[3,4]. 同時已有研究發(fā)現(xiàn), 部分腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平與GC患者術(shù)后生存期存現(xiàn)相關(guān)性, 可作為GC患者預(yù)后或治療反應(yīng)率的生物學(xué)分子標(biāo)志物[5,6]. 在本研究中, 我們探討Kruppel樣因子5(kruppel-like factor 5,KLF5)基因表達(dá)水平在GC組織中及正常胃粘膜中是否存在差異表達(dá), 及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料 選取Oncomine (https://www.oncomine.org/)和Kaplan-Meier plotter (www.kmplot.com)數(shù)據(jù)庫為KLF5基因表達(dá)數(shù)據(jù)挖掘研究對象, 對GC組織與正常組織KLF5基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析. 同時回顧性分析天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院2016-01/2018-12收治并手術(shù)治療的GC患者41例為臨床標(biāo)本研究對象進(jìn)行KLF5蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征相關(guān)性分析.

1.2 方法

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)分析: 在Oncomine數(shù)據(jù)庫我們檢索KLF5相關(guān)數(shù)據(jù)集, 限定條件為: (1)腫瘤類型: 胃腫瘤; (2)組織對比: 腫瘤組織vs正常組織; (3)數(shù)據(jù)類型:mRNA; (4)顯著性:P＜1E-4; (5)差異表達(dá)級別: 大于2倍;(6)基因排序: 前10%.

1.2.2 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析: 在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析平臺中, 我們檢索KLF5基因, 并應(yīng)用在線分析軟件繪制KLF5高低表達(dá)的生存曲線. 限定條件為總生存和無疾病進(jìn)展生存, 對腫瘤病理類型, 臨床分期, 分級等不做限制.

1.2.3 免疫組化: 石蠟切片脫蠟水化, 蒸餾水浸泡沖洗后行抗原修復(fù), PBS沖洗后滴加動物非免疫血清, 室溫孵育10 min后傾去. 滴加一抗, 室溫孵育60 min, 陰性對照用PBS代替. PBS沖洗后, 滴加生物素標(biāo)記的二抗, 室溫孵育10 min. PBS沖洗干凈后滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液, 室溫孵育30 min. PBS沖洗, DAB顯色劑顯色, 中性樹膠封片. 根據(jù)腫瘤細(xì)胞顯色的比例及染色強(qiáng)度,KLF5表達(dá)做半定量判定. 按顯色程度評分: 弱染色為1分; 中等染色為2分; 強(qiáng)染色為3分. 按陽性細(xì)胞率評分: 陽性細(xì)胞數(shù)占10%＜50%為2分; 50%＜80%為3分; ≥80%為4分. 無論染色強(qiáng)度如何, 細(xì)胞陽性率＜10%為陰性; (-); 評2分以上為陽性(+).

統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件完成, 定量數(shù)據(jù)應(yīng)用mean±SD表示, 組間比較采用t檢驗(yàn); 定性數(shù)據(jù)采用率表示, 組間采用χ2檢驗(yàn); 生存分析繪制生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn),P＜0.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1KLF5在常見腫瘤中的表達(dá) 截止到2019-03, Oncomine數(shù)據(jù)庫共收錄了424個關(guān)于KLF5基因表達(dá)水平的相關(guān)研究, 其中在癌組織vs正常組織中差異表達(dá)的有35個,與正常組織相比, 8個數(shù)據(jù)集結(jié)果提示KLF5在癌組織中高表達(dá), 27個數(shù)據(jù)集在癌組織中低表達(dá)(圖1).

2.2KLF5在胃腫瘤中與其他基因共表達(dá)情況 我們應(yīng)用Oncomine提供的在線分析功能, 對KLF5在GC中的共表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析(圖2). 結(jié)果顯示,KLF5與ST14,TMEM125等20個基因存在共表達(dá)情況(在GC中共同低表達(dá)或高表達(dá)), 提示這些共表達(dá)基因在功能上可能存在相關(guān)性.

2.3KLF5在胃腫瘤的中表達(dá) 通過對Oncomine數(shù)據(jù)挖掘, 我們發(fā)現(xiàn)10個mRNA芯片數(shù)據(jù)集對比分析了GC組織與正常組織中KLF5基因的差異表達(dá)情況(圖3). 10個基因芯片中, 有4個芯片數(shù)據(jù)提示了GC組織中KLF5表達(dá)水平明顯升高.

2.4KLF5表達(dá)與患者預(yù)后 我們進(jìn)一步對Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中,KLF5表達(dá)水平與GC患者預(yù)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘, 并發(fā)現(xiàn)2個相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù), 分別為Affy ID: 209211_at和209212_s_at. 我們應(yīng)用在線分析軟件回執(zhí)了KLF5高低表達(dá)的生存曲線(圖4). 結(jié)果顯示,KLF5高表達(dá)患者總生存和無疾病進(jìn)展生存均小于低表達(dá)組(P＜0.05)(表1).

2.5 免疫組化檢測KLF5蛋白表達(dá)及其與患者臨床病理特征KLF5主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì), 呈棕褐色顆粒狀均勻分布(圖5). 41例GC患者中,KLF5陽性表達(dá)者29例, 陽性率為70.7(29/41).KLF5陽性表達(dá)與患者臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤分期、分級等無明顯相關(guān)性(P＞0.05)(表2).

3 討論

KLF5是真核生物中的基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白2, 是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子, 也被稱為腸道富集Kruppel樣因子(intestinal-enriched kruppel-Like factor, IKLF), 其通過激活或抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步調(diào)控基因表達(dá)的組織特異性和時間特異性, 同時在細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要的作用[7-9]. 人KLF5染色體13q21區(qū)域,KLF5蛋白包含457個氨基酸, 分子量為55kDa, 其CDS編碼區(qū)含有一個激活結(jié)構(gòu)域和一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7,10,11].KLF5含有許多靶基因, 如核因子kB,過氧化物酶增生物激活受體, 血小板源性生長因子a和T細(xì)胞抗原受體等, 在不同的細(xì)胞模型中這些基因都已被證實(shí)[12-14].KLF5作為一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子, 通過調(diào)節(jié)富含GC的啟動子區(qū)域的表達(dá), 進(jìn)一步參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、個體發(fā)育等過程.

表1 KLF5表達(dá)與患者總生存及中為生存相關(guān)性

圖1 KLF5在常見腫瘤中的表達(dá)情況分析.

已有研究顯示, 與對應(yīng)的正常組織相比,KLF5在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá), 如GC[15]、結(jié)直腸癌[16,17]、肺癌、乳腺癌等[18-20]. 但KLF5在腫瘤患者癌組織中的高表達(dá)是否與患者的預(yù)后及臨床病理特征相關(guān), 目前研究結(jié)果并不一致. 有研究認(rèn)為,KLF5在腫瘤組織中的高表達(dá)往往與患者的預(yù)后不良有關(guān), 高表達(dá)者中位生存時間及無疾病進(jìn)展生存時間明顯減低, 且KLF5的陽性表達(dá)往往與腫瘤的低分化及更高的臨床分期有關(guān)[21]. 張小玲等[22]人采用采用免疫組化SP法檢測79例GC組織和40例正常胃組織中KLF5的表達(dá), 分析了KLF5表達(dá)與患者臨床病例特征和預(yù)后的關(guān)系. 結(jié)果認(rèn)為KLF5表達(dá)與GC分化程度、浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān), 是GC不良預(yù)后的危險因素, 可作為GC預(yù)后評價的客觀指標(biāo). 但亦有研究認(rèn)為,KLF5表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后無關(guān), 高低表達(dá)患者遠(yuǎn)期生存率無明顯差異[23].

由于KLF5表達(dá)水平與GC患者預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系并不明確, 我們采用Oncomie和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中關(guān)于KLF5基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘, 探尋KLF5基因在GC組織與正常胃組織中的差異表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系. 同時對41例GC患者的腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測, 分析KLF5表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性. 在研究中我們發(fā)現(xiàn), 與正常胃組織比較, GC組織中KLF5基因的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào), 且高表達(dá)與患者的預(yù)后不良有關(guān). 而KLF5表達(dá)與患者的臨床病理特征無相關(guān)性, 但由于納入樣本量較小, 這種弱的相關(guān)性可能并未被小樣本實(shí)驗(yàn)所證實(shí). 因此,KLF5高表達(dá)GC患者遠(yuǎn)期生存率低有關(guān),提示其可作為GC患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的等預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物. 也可能成為GC靶向治療的及藥物研發(fā)的分子靶點(diǎn). 但本研究也存現(xiàn)一定的局限性, 免疫組織化學(xué)驗(yàn)證部分入組患者例數(shù)較少, 統(tǒng)計學(xué)效能較低, 且未進(jìn)行隨訪評價KLF5表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系. 因此, 下一步我們將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量, 延長隨訪時間, 明確KLF5高低表達(dá)與GC患者生存期的關(guān)系.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer, GC)是較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤, 大多數(shù)患者就診時已發(fā)展為晚期, 預(yù)后不良. 同時缺乏GC預(yù)后的分子標(biāo)志物. Kruppel樣因子5(kruppel-like factor 5,KLF5)在多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)差異表達(dá), 并與患者的預(yù)后有關(guān). 而KLF5在GC中的表達(dá)水平及其與GC患者的預(yù)后關(guān)系不清.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

探討KLF5在GC中的表達(dá)及其與GC患者預(yù)后的關(guān)系,評價其作為GC預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性.

表2 KLF5蛋白表達(dá)及其與患者臨床病理特征(n)

圖2 KLF5基因共表達(dá)分析提示KLF5與ST14, TMEM125等20個基因存在共表達(dá)情況.

圖3 KLF5在胃腫瘤的中表達(dá)基因芯片項(xiàng)數(shù)據(jù)集.

圖4 KLF5表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系的生存曲線.

圖5 KLF5在胃癌和正常胃黏膜中的表達(dá)情況.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

通過生物信息分析和組織標(biāo)本驗(yàn)證, 揭示KLF5在GC中的差異表達(dá)情況, 并進(jìn)一步明確其差異表達(dá)與患者生存期的關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)方法

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫分析KLF5在GC中的差異表達(dá); 通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析KLF5高低表達(dá)與GC患者生存期的關(guān)系; 最后通過免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行證實(shí).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Oncomine數(shù)據(jù)庫分析提示GC組織中KLF5表達(dá)水平明顯升高. Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)分析顯示KLF5高表達(dá)患者總生存和無疾病進(jìn)展生存均小于低表達(dá)組(P＜0.05). 免疫組化分析顯示KLF5陽性表達(dá)與患者臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤分期、分級等無明顯相關(guān)性(P＞0.05).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)KLF5在GC中高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后有關(guān), 而KLF5表達(dá)與患者臨床病理特征無關(guān). 本研究提出KLF5高表達(dá)患者總生存和無疾病進(jìn)展生存期較低.檢測KLF5在GC患者中的表達(dá)水平可作為GC預(yù)后的分子標(biāo)志物. 為評估GC患者的生存期提供基礎(chǔ).

展望前景

KLF5在GC中的差異表達(dá)為其預(yù)后評價提供了可行性,并綜合其他指標(biāo)有望建立GC患者生存期預(yù)測模型, 為GC換的預(yù)后提供評價方法.