甄曉蘭 崔曉燕 劉雪莉 牛嗣云

(1河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊 050051；2河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

隨著年齡的增長，人體的細(xì)胞、組織、器官在結(jié)構(gòu)和功能上逐漸退化。睪丸作為男性生殖系統(tǒng)的重要器官，睪丸功能的減退是衰老的早期信號之一。男性衰老導(dǎo)致的睪丸功能衰退，精子質(zhì)量下降，甚至產(chǎn)生性功能障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥在延緩衰老過程中發(fā)揮重要作用〔1〕。松果菊苷是肉蓯蓉的主要生物活性成分，通過保護(hù)精子和增加精子的產(chǎn)量提高男性的性功能〔2〕。本文旨在探討松果菊苷對大鼠生精細(xì)胞中胰島素通路胰島素受體底物(IRS)1、胰島素樣生長因子(IGF)-1、IGF結(jié)合蛋白(IGFBP)3基因表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1生精細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 ①支持細(xì)胞：取17～21 d的Wistar大鼠，深度麻醉至死，取出雙側(cè)睪丸置于預(yù)冷的 D-Hanks液中，使用Ⅳ型膠原酶和胰蛋白酶消化使精曲小管斷裂，將支持細(xì)胞培養(yǎng)在含 10%胎牛血清(FBS)的 DMEM/F12 的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，轉(zhuǎn)移上清液至另一新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。②精原干細(xì)胞：取7～9 d的Wistar大鼠睪丸組織，深度麻醉至死，取出雙側(cè)睪丸置于預(yù)冷的 D-Hanks液中，采用兩步酶消化法和差異貼壁法分離純化精原干細(xì)胞，置于 34 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中計數(shù)，(5～7)×105/ml接種到支持細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)7d〔3〕。

1.2細(xì)胞衰老模型建立和鑒定 將分離培養(yǎng)的精原干細(xì)胞，置于含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，與支持細(xì)胞共培養(yǎng)7 d，采用自由基氧化損傷方法，加入濃度為 50 μmol/L H2O2和 100 μmol/L硫酸亞鐵(FeSO4)，連續(xù)干預(yù)8 h，更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，β-半乳糖甘酶染色鑒定。

1.3細(xì)胞分組 根據(jù)實(shí)驗?zāi)康膶⑸?xì)胞分為3組：正常組(NG)，將培養(yǎng)至7 d的生精細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；衰老模型組(AG)，將生精細(xì)胞培養(yǎng)至7 d,加入終濃度為 50 μmol/L的H2O2和 100 μmol/L FeSO4，連續(xù)干預(yù)8 h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h；松果菊苷組(SGJG)，將生精細(xì)胞培養(yǎng)至7 d，加入終濃度分別為 50 μmol/L的H2O2和 100 μmol/L FeSO4，連續(xù)干預(yù)8 h，換液，加入終濃度為20 μmol/L的松果菊苷，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.4實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) Trizol 法提取生精細(xì)胞總核糖核酸(RNA)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將總RNA反轉(zhuǎn)錄到補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，以反轉(zhuǎn)錄后的單鏈 cDNA 為模板，使用SYBR熒光染料，高效PCR酶進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，用β-actin作內(nèi)參。利用2-ΔΔct分析方法并結(jié)合 SPSS19.0 軟件對qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列和各個基因的退火溫度

1.5免疫熒光技術(shù) 多聚甲醛固定細(xì)胞爬片30 min，用0.5%Triton X-100透化20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。與5%血清白蛋白在室溫孵育20 min，封閉非特異性位點(diǎn)，一抗孵育4℃過夜。次日PBS洗滌并在37 ℃條件下與二抗孵育1 h后，PBS洗滌。在室溫下與4'-6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育20 min，用PBS洗滌，室溫晾干，50%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個視野，每個視野求得平均光密度。每組實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6Western印跡 用裂解緩沖液裂解細(xì)胞蛋白，使用牛血清白蛋白(BSA)測定算蛋白質(zhì)濃度。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰凝膠電泳(SDS-PAGE)分離80 μg蛋白質(zhì)裂解物并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。脫脂奶粉室溫封閉1 h后，一抗孵育4℃過夜。次日，二抗室溫孵育2 h，PBS-吐溫(T)洗滌，顯影。實(shí)驗重復(fù)3次，所得圖像采用Image J軟件記錄各個蛋白的ID值(灰度值)，β-actin為內(nèi)參，目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的ID值/β-actin ID值。

1.7統(tǒng)計分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、Dunnettt檢驗。

2 結(jié) 果

2.1松果菊苷對生精細(xì)胞 IRS1、IGF1、IGFBP3 蛋白表達(dá)的影響 熒光染色細(xì)胞核用DAPI 染色呈藍(lán)色，IRS1、IRS2、IGFBP3陽性產(chǎn)物發(fā)紅色熒光，陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。

圖1 生精細(xì)胞中IRS1，IGF1和IGFBP3的平均光密度

AG IRS1，IGF1的平均光密度明顯低于NG，IGFBP3陽性率明顯高于NG。SGJG組IRS1、IGF1的平均光密度明顯高于AG，IGFBP3 平均光密度明顯低于AG。見表2。IRS1，IGF1和IGFBP3的蛋白表達(dá)趨勢與免疫熒光染色一致，見圖2、表3。

表2 生精細(xì)胞中IRS1、IGF1和IGFBP3免疫熒光平均光密度

與NG比較：1)P<0.05；與AG比較：2)P<0.05；下表同

圖2 IRS1、IGF1和IGFBP3蛋白在生精細(xì)胞中的表達(dá)水平

組別IRS1IGF1IGFBP3NG0.95±0.020.83±0.040.96±0.04AG0.57±0.041)0.44±0.031)1.28±0.031)SGJG0.73±0.042)0.61±0.032)0.92±0.012)F值918.64107.12151.13P值<0.001<0.001<0.001

2.2松果菊苷對生精細(xì)胞 IRS1、IGF1、IGFBP3 mRNA 表達(dá)水平的影響 AG IRS1，IGF1mRNA表達(dá)水平明顯低于NG，IGFBP3 mRNA表達(dá)水平明顯高于NG。SGJG IRS1，IGF1 mRNA表達(dá)水平明顯高于AG，IGFBP3 mRNA表達(dá)水平明顯低于AG，見表4。

表4 生精細(xì)胞中IRS1、IGF1和IGFBP3mRNA的表達(dá)水平

2.3各組生精細(xì)胞 IGF1/IGFBP3 比值的變化 IGF1/IGFBP3 比值增加可減少抑制生精細(xì)胞的凋亡率。AG IGF1/IGFBP3比值與NG的比較，在mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降；SGJG與AG比較，IGF1/IGFBP3比值顯著升高，表明松果菊苷可通過調(diào)節(jié)IGF-1/IGFBP3 比值抑制生精細(xì)胞的凋亡。見表5。

表5 生精細(xì)胞中IGF1/IGFBP3 比值

3 討 論

研究證明老年男性血睪屏障出現(xiàn)異常，支持細(xì)胞數(shù)量減少，打破生精細(xì)胞生成和凋亡的動態(tài)平衡，導(dǎo)致精子減少，甚至生殖功能的衰退〔4，5〕。IGF1 作為一種特異性神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進(jìn)有絲分裂，調(diào)節(jié)著細(xì)胞生長、增殖和分化，這種多效性作用對生殖至關(guān)重要〔6〕。IGF1 與多種性激素和細(xì)胞因子相互作用調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)睪酮合成并調(diào)節(jié)精子產(chǎn)生〔7〕。IRS是IGF1 受體和酪氨酸激酶的底物〔8〕。胰島素受體底物蛋白IRS1是胰島素受體酪氨酸激酶的關(guān)鍵靶標(biāo)，參與代謝的激素控制〔9〕。IGFBP3是IGF1的結(jié)合蛋白，IGFBP3與IGF1 結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)一步抑制周邊細(xì)胞的生長和有絲分裂及抗凋亡的生物學(xué)功能〔10，11〕。IGFBP3-IGF1的結(jié)合力明顯要高于IGF1R-IGF1的親和力，IGFBP3-IGF1一旦結(jié)合將抑制IGF1與IGF1R的結(jié)合，阻斷IGF1對細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。IRS1、IGF1、IGFBP3是胰島素信號通路的關(guān)鍵基因，該結(jié)果表明胰島素信號通路在生精細(xì)胞衰老中具有重要作用。松果菊苷通過提高生精細(xì)胞 IRS1、IGF1 mRNA 和蛋白表達(dá)，抑制IGFBP3 mRNA和蛋白表達(dá)，提高IGF-1/IGFBP3 比值，從而改變生精細(xì)胞的衰老狀態(tài)。