張少君 陳小娟 李若蘭 李才應(yīng) 鄧梓濠 吳建聰
廣州醫(yī)科大學(xué) (廣州510000)
隨著城市節(jié)奏加快和生活壓力加重,缺血性腦血管病發(fā)病率逐年上升,有研究表明,腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙[1],而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對(duì)缺血較敏感[2],腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能會(huì)減退或喪失,嚴(yán)重影響身心健康和生活質(zhì)量。在腦缺血再灌注損傷時(shí),大腦缺血邊緣區(qū)(半暗區(qū))細(xì)胞以凋亡為主要死亡方式,而調(diào)控細(xì)胞凋亡最主要的基因是Bax,它是Bcl-2基因家族中的一員。大量研究表明,Bax的表達(dá)大幅度增加可以促進(jìn)caspase3激活而抗凋亡[3- 4],但Bcl-2的大量表達(dá)可抑制caspase3的激活而起到抗凋亡作用[5];另外,Bax還可以通過(guò)編碼能與Bcl-2結(jié)合成異二聚體的Bax蛋白,從而拮抗Bcl-2的作用。因此,Bax和Bcl-2的表達(dá)情況以及Bax/Bcl-2的比率對(duì)細(xì)胞凋亡有著重要的影響。因此,為了給臨床研究降低腦缺血再灌注損傷提供思路,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腦缺血再灌注模型,探討腦缺血再灌注損傷對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。
選用健康的4周齡小鼠20只,自由飲食飲水飼養(yǎng),自然光暗周期。(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求)。增強(qiáng)型 DAB 顯色試劑盒,由北京索萊寶科技有限公司提供,貨號(hào):DA1015;SABC 免疫組化染色試劑盒,由博士德生物工程有限公司提供,產(chǎn)品編號(hào):SA1020;Morris水迷宮全套設(shè)備,由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。
選用健康的4周齡小鼠20只,隨機(jī)分為空白組10只;實(shí)驗(yàn)組(缺血24 h組)10只;稱重,用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉, 待小鼠無(wú)翻正反射后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,保持呼吸通暢,用碘伏消毒,經(jīng)頸部做 0.8~1 cm 正中切口,切開皮膚和皮下組織,鈍性分離二腹肌和胸鎖乳突肌,暴露頸動(dòng)脈鞘,小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)約 0.5~1 cm,并在頸總動(dòng)脈下穿過(guò)零號(hào)絲線。提拉絲線,同一時(shí)間,用無(wú)創(chuàng)傷性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20min, 然后去除動(dòng)脈夾,逐層縫合肌肉、皮膚,再次消毒。正常飼養(yǎng)3天,待小鼠傷口愈合,進(jìn)行水迷宮行為學(xué)。
將兩組小鼠分別放在Morris水迷宮內(nèi)尋找平臺(tái),人為將水迷宮劃分為4個(gè)象限,每天下午同一時(shí)間將受試小鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来斡傻谝唬?,三,四入水點(diǎn)順序放入水中,記錄小鼠在2min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間,如果小鼠在2min內(nèi)找到平臺(tái),記錄2min內(nèi)的逃避潛伏期,如果2min內(nèi)未找到平臺(tái),由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留10s,逃避潛伏期記錄為2min。訓(xùn)練小鼠歷時(shí)4天。4天訓(xùn)練逃避潛伏期結(jié)束后,次日將水迷宮內(nèi)的平臺(tái)移除,讓兩組小鼠從原來(lái)平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限進(jìn)入水迷宮,用Smart系統(tǒng)測(cè)其在5min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)和小鼠在平臺(tái)各個(gè)象限停留的時(shí)間,以判斷小鼠記憶儲(chǔ)存以及提取再現(xiàn)能力。
1.4.1 腦片標(biāo)本制作
將以上跑完水迷宮后的空白組和缺血組小鼠灌注取腦,質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定12 h,依次用質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L的蔗糖脫水,制作冰凍切片。
1.4.2 免疫組化檢測(cè)步驟如下:
選取含海馬區(qū)的冰凍切片于孔板內(nèi),用PBS溶液沖洗;質(zhì)量濃度為30 g/L的H2O2去離子水室溫孵育5~10min, 消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS(AR,30)沖洗5min,沖洗3次;質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA封閉液 37 ℃孵育30min,甩干。滴加一抗,37 ℃孵育1~2 h或4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗,5min×3次;滴加生物素標(biāo)記IgG,37 ℃孵育30min。PBS沖洗5min,沖洗3次;滴加 SABC,37 ℃孵育30min;PBS沖洗5min,沖洗3次。DAB染色,復(fù)染、脫水、透明、封片。
1.4.3 Bax,Bcl-2檢測(cè)方法
陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):在200倍光學(xué)顯微鏡下在腦組織海馬區(qū)切片內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。并分別記錄每組切片Bax和Bcl-2染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。
采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組之間采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.1 空白組在D3、D4逃避潛伏期最短,D5穿越平臺(tái)次數(shù)最多,目標(biāo)象限停留時(shí)間最長(zhǎng),空白組小鼠的活動(dòng)區(qū)域集中于目標(biāo)象限;與空白組比較, 實(shí)驗(yàn)組D3、D4逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)、D5穿越平臺(tái)次數(shù)減少 (P<0.05),小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢(shì)。其余沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(目標(biāo)象限停留時(shí)間沒(méi)有差異)。(見表1)
表1 小鼠Morris水迷宮數(shù)據(jù)(s)
2.1.2 在空間探索階段,空白組小鼠在目標(biāo)象限活動(dòng)路徑長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組,路徑圖呈趨向型搜索策略;實(shí)驗(yàn)組小鼠在各個(gè)象限路徑長(zhǎng)短沒(méi)有差異,呈現(xiàn)邊緣型搜索策略。(見圖1)
圖1 小鼠空間探索階段路徑圖
2.2.1 Bcl-2表達(dá)情況 空白組第9天Bcl-2表達(dá)量為2.91±2.09,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為26.18±17.52;與空白組相比,實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均增加(P<0.05)。
2.2.2 Bax表達(dá)情況 空白組第9天Bax表達(dá)量為3.97±4.09,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為63.60±12.77;與空白組比較,實(shí)驗(yàn)組的Bax蛋白表達(dá)水平增加 (P<0.05)。
空白組Bcl-2/Bax比值為0.92±0.52,實(shí)驗(yàn)組Bcl-2/Bax比值為0.44±0.29,說(shuō)明Bax在9 d內(nèi)相比Bcl-2表達(dá)增幅較大。(見圖2、3)
圖2 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bcl-2表達(dá)情況)A空白組;B實(shí)驗(yàn)組
圖3 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bax表達(dá)情況)A空白組;B實(shí)驗(yàn)組
腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙,而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對(duì)缺血較敏感。而Morris水迷宮是利用小鼠尋找水中的休息場(chǎng)所的本能, 通過(guò)定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個(gè)部分來(lái)測(cè)試小鼠對(duì)空間位置感和方向感 (空間定位) 的學(xué)習(xí)記憶能力。并且在固定時(shí)間進(jìn)行,選取同年齡同性別小鼠,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持水迷宮之外的一切物品靜止,以達(dá)到盡量減少外部因素對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾的目的[7],本實(shí)驗(yàn)用Morris水迷宮的定位航行試驗(yàn),對(duì)比實(shí)驗(yàn)組(缺血再灌注小鼠)與空白組(未做任何處理的正常小鼠)的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較, 實(shí)驗(yàn)組小鼠逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明缺血再灌注影響了小鼠的學(xué)習(xí)記憶,缺血再灌注模型制作成功。
有研究表明,細(xì)胞凋亡是造成小鼠大腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元丟失的重要原因[8],而且神經(jīng)元的凋亡會(huì)加重再灌注后對(duì)海馬區(qū)的損傷。Bcl-2、Bax基因調(diào)控的蛋白在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。Bcl-2蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用,而Bax蛋白則對(duì)細(xì)胞凋亡具有一定的促進(jìn)作用[9]。另外,近年來(lái)大量研究提示,Bcl-2家族調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展取決于促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制凋亡蛋白Bax的相對(duì)濃度[10],所以Bcl-2/Bax也可以間接地反映細(xì)胞凋亡的情況。
本實(shí)驗(yàn)中,未做任何處理的空白組小鼠海馬區(qū)Bax和Bcl-2均有少量表達(dá),實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注9天后的小鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達(dá)均大幅度提高,并且Bax上升的幅度較Bcl-2大。相關(guān)實(shí)驗(yàn)也表明正常情況下Bcl-2、Bax僅有微弱的表達(dá),而模型組Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)增加[11]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,實(shí)驗(yàn)組Bcl-2/Bax比值較空白組降低,表明Bcl-2/Bax的下調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡亦有密切的關(guān)系。他人研究已發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax的比值變化決定細(xì)胞的凋亡與生存,比值越高,細(xì)胞存活率越高;比值越低,細(xì)胞的凋亡率越高[12],本研究結(jié)果與其相符。
綜上所述,Bax在小鼠缺血再灌注模型中起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,Bcl-2/Bax比值下調(diào)也與細(xì)胞凋亡有關(guān),對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶造成影響。