張少君 陳小娟 李若蘭 李才應(yīng) 鄧梓濠 吳建聰

廣州醫(yī)科大學(xué) (廣州510000)

隨著城市節(jié)奏加快和生活壓力加重，缺血性腦血管病發(fā)病率逐年上升，有研究表明，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙[1]，而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對(duì)缺血較敏感[2]，腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能會(huì)減退或喪失，嚴(yán)重影響身心健康和生活質(zhì)量。在腦缺血再灌注損傷時(shí)，大腦缺血邊緣區(qū)(半暗區(qū))細(xì)胞以凋亡為主要死亡方式，而調(diào)控細(xì)胞凋亡最主要的基因是Bax，它是Bcl-2基因家族中的一員。大量研究表明，Bax的表達(dá)大幅度增加可以促進(jìn)caspase3激活而抗凋亡[3- 4]，但Bcl-2的大量表達(dá)可抑制caspase3的激活而起到抗凋亡作用[5]；另外，Bax還可以通過(guò)編碼能與Bcl-2結(jié)合成異二聚體的Bax蛋白，從而拮抗Bcl-2的作用。因此，Bax和Bcl-2的表達(dá)情況以及Bax/Bcl-2的比率對(duì)細(xì)胞凋亡有著重要的影響。因此，為了給臨床研究降低腦缺血再灌注損傷提供思路，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腦缺血再灌注模型，探討腦缺血再灌注損傷對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康的4周齡小鼠20只，自由飲食飲水飼養(yǎng)，自然光暗周期。(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求)。增強(qiáng)型 DAB 顯色試劑盒，由北京索萊寶科技有限公司提供，貨號(hào)：DA1015；SABC 免疫組化染色試劑盒，由博士德生物工程有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)：SA1020；Morris水迷宮全套設(shè)備，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1.2 動(dòng)物模型[6]

選用健康的4周齡小鼠20只，隨機(jī)分為空白組10只；實(shí)驗(yàn)組(缺血24 h組)10只；稱重，用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉， 待小鼠無(wú)翻正反射后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,保持呼吸通暢,用碘伏消毒,經(jīng)頸部做 0.8～1 cm 正中切口，切開皮膚和皮下組織,鈍性分離二腹肌和胸鎖乳突肌，暴露頸動(dòng)脈鞘，小心分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)約 0.5～1 cm，并在頸總動(dòng)脈下穿過(guò)零號(hào)絲線。提拉絲線，同一時(shí)間，用無(wú)創(chuàng)傷性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20min， 然后去除動(dòng)脈夾，逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。正常飼養(yǎng)3天，待小鼠傷口愈合，進(jìn)行水迷宮行為學(xué)。

1.3 水迷宮行為學(xué)

將兩組小鼠分別放在Morris水迷宮內(nèi)尋找平臺(tái)，人為將水迷宮劃分為4個(gè)象限，每天下午同一時(shí)間將受試小鼠按順時(shí)針?lè)较蛞来斡傻谝唬?，三，四入水點(diǎn)順序放入水中，記錄小鼠在2min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間，如果小鼠在2min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄2min內(nèi)的逃避潛伏期，如果2min內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺(tái)并停留10s，逃避潛伏期記錄為2min。訓(xùn)練小鼠歷時(shí)4天。4天訓(xùn)練逃避潛伏期結(jié)束后，次日將水迷宮內(nèi)的平臺(tái)移除，讓兩組小鼠從原來(lái)平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限進(jìn)入水迷宮，用Smart系統(tǒng)測(cè)其在5min內(nèi)跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)和小鼠在平臺(tái)各個(gè)象限停留的時(shí)間，以判斷小鼠記憶儲(chǔ)存以及提取再現(xiàn)能力。

1.4 免疫組化

1.4.1 腦片標(biāo)本制作

將以上跑完水迷宮后的空白組和缺血組小鼠灌注取腦，質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定12 h，依次用質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L的蔗糖脫水，制作冰凍切片。

1.4.2 免疫組化檢測(cè)步驟如下:

選取含海馬區(qū)的冰凍切片于孔板內(nèi)，用PBS溶液沖洗；質(zhì)量濃度為30 g/L的H2O2去離子水室溫孵育5～10min， 消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS(AR,30)沖洗5min，沖洗3次；質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA封閉液 37 ℃孵育30min，甩干。滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗，5min×3次；滴加生物素標(biāo)記IgG，37 ℃孵育30min。PBS沖洗5min，沖洗3次；滴加 SABC，37 ℃孵育30min；PBS沖洗5min，沖洗3次。DAB染色，復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4.3 Bax，Bcl-2檢測(cè)方法

陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在200倍光學(xué)顯微鏡下在腦組織海馬區(qū)切片內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)免疫組化染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)。并分別記錄每組切片Bax和Bcl-2染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 空白組在D3、D4逃避潛伏期最短,D5穿越平臺(tái)次數(shù)最多，目標(biāo)象限停留時(shí)間最長(zhǎng)，空白組小鼠的活動(dòng)區(qū)域集中于目標(biāo)象限；與空白組比較, 實(shí)驗(yàn)組D3、D4逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)、D5穿越平臺(tái)次數(shù)減少 (P<0.05)，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢(shì)。其余沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(目標(biāo)象限停留時(shí)間沒(méi)有差異)。(見表1)

表1 小鼠Morris水迷宮數(shù)據(jù)(s)

2.1.2 在空間探索階段，空白組小鼠在目標(biāo)象限活動(dòng)路徑長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組，路徑圖呈趨向型搜索策略；實(shí)驗(yàn)組小鼠在各個(gè)象限路徑長(zhǎng)短沒(méi)有差異，呈現(xiàn)邊緣型搜索策略。(見圖1)

圖1 小鼠空間探索階段路徑圖

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2.1 Bcl-2表達(dá)情況 空白組第9天Bcl-2表達(dá)量為2.91±2.09，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為26.18±17.52；與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均增加(P<0.05)。

2.2.2 Bax表達(dá)情況 空白組第9天Bax表達(dá)量為3.97±4.09，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量為63.60±12.77；與空白組比較,實(shí)驗(yàn)組的Bax蛋白表達(dá)水平增加 (P<0.05)。

空白組Bcl-2/Bax比值為0.92±0.52，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2/Bax比值為0.44±0.29，說(shuō)明Bax在9 d內(nèi)相比Bcl-2表達(dá)增幅較大。(見圖2、3)

圖2 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bcl-2表達(dá)情況)A空白組；B實(shí)驗(yàn)組

圖3 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bax表達(dá)情況)A空白組；B實(shí)驗(yàn)組

3 討 論

腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙，而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對(duì)缺血較敏感。而Morris水迷宮是利用小鼠尋找水中的休息場(chǎng)所的本能, 通過(guò)定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個(gè)部分來(lái)測(cè)試小鼠對(duì)空間位置感和方向感 (空間定位) 的學(xué)習(xí)記憶能力。并且在固定時(shí)間進(jìn)行，選取同年齡同性別小鼠，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持水迷宮之外的一切物品靜止，以達(dá)到盡量減少外部因素對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾的目的[7],本實(shí)驗(yàn)用Morris水迷宮的定位航行試驗(yàn)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組(缺血再灌注小鼠)與空白組(未做任何處理的正常小鼠)的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較, 實(shí)驗(yàn)組小鼠逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明缺血再灌注影響了小鼠的學(xué)習(xí)記憶，缺血再灌注模型制作成功。

有研究表明，細(xì)胞凋亡是造成小鼠大腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元丟失的重要原因[8]，而且神經(jīng)元的凋亡會(huì)加重再灌注后對(duì)海馬區(qū)的損傷。Bcl-2、Bax基因調(diào)控的蛋白在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用。Bcl-2蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，而Bax蛋白則對(duì)細(xì)胞凋亡具有一定的促進(jìn)作用[9]。另外，近年來(lái)大量研究提示，Bcl-2家族調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展取決于促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制凋亡蛋白Bax的相對(duì)濃度[10]，所以Bcl-2/Bax也可以間接地反映細(xì)胞凋亡的情況。

本實(shí)驗(yàn)中，未做任何處理的空白組小鼠海馬區(qū)Bax和Bcl-2均有少量表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注9天后的小鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達(dá)均大幅度提高，并且Bax上升的幅度較Bcl-2大。相關(guān)實(shí)驗(yàn)也表明正常情況下Bcl-2、Bax僅有微弱的表達(dá)，而模型組Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)增加[11]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2/Bax比值較空白組降低，表明Bcl-2/Bax的下調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡亦有密切的關(guān)系。他人研究已發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax的比值變化決定細(xì)胞的凋亡與生存，比值越高，細(xì)胞存活率越高；比值越低，細(xì)胞的凋亡率越高[12]，本研究結(jié)果與其相符。

綜上所述，Bax在小鼠缺血再灌注模型中起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax比值下調(diào)也與細(xì)胞凋亡有關(guān)，對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶造成影響。