張少君 陳小娟 李若蘭 李才應(yīng) 鄧梓濠 吳建聰

廣州醫(yī)科大學(xué) (廣州510000)

隨著城市節(jié)奏加快和生活壓力加重，缺血性腦血管病發(fā)病率逐年上升，有研究表明，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙[1]，而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對缺血較敏感[2]，腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能會減退或喪失，嚴重影響身心健康和生活質(zhì)量。在腦缺血再灌注損傷時，大腦缺血邊緣區(qū)(半暗區(qū))細胞以凋亡為主要死亡方式，而調(diào)控細胞凋亡最主要的基因是Bax，它是Bcl-2基因家族中的一員。大量研究表明，Bax的表達大幅度增加可以促進caspase3激活而抗凋亡[3- 4]，但Bcl-2的大量表達可抑制caspase3的激活而起到抗凋亡作用[5]；另外，Bax還可以通過編碼能與Bcl-2結(jié)合成異二聚體的Bax蛋白，從而拮抗Bcl-2的作用。因此，Bax和Bcl-2的表達情況以及Bax/Bcl-2的比率對細胞凋亡有著重要的影響。因此，為了給臨床研究降低腦缺血再灌注損傷提供思路，本實驗通過建立腦缺血再灌注模型，探討腦缺血再灌注損傷對學(xué)習(xí)記憶的影響及海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康的4周齡小鼠20只，自由飲食飲水飼養(yǎng)，自然光暗周期。(實驗動物由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物實驗中心提供，符合相關(guān)實驗要求)。增強型 DAB 顯色試劑盒，由北京索萊寶科技有限公司提供，貨號：DA1015；SABC 免疫組化染色試劑盒，由博士德生物工程有限公司提供，產(chǎn)品編號：SA1020；Morris水迷宮全套設(shè)備，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。

1.2 動物模型[6]

選用健康的4周齡小鼠20只，隨機分為空白組10只；實驗組(缺血24 h組)10只；稱重，用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉， 待小鼠無翻正反射后仰臥固定于手術(shù)臺上,保持呼吸通暢,用碘伏消毒,經(jīng)頸部做 0.8～1 cm 正中切口，切開皮膚和皮下組織,鈍性分離二腹肌和胸鎖乳突肌，暴露頸動脈鞘，小心分離雙側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)約 0.5～1 cm，并在頸總動脈下穿過零號絲線。提拉絲線，同一時間，用無創(chuàng)傷性微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈20min， 然后去除動脈夾，逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。正常飼養(yǎng)3天，待小鼠傷口愈合，進行水迷宮行為學(xué)。

1.3 水迷宮行為學(xué)

將兩組小鼠分別放在Morris水迷宮內(nèi)尋找平臺，人為將水迷宮劃分為4個象限，每天下午同一時間將受試小鼠按順時針方向依次由第一，二，三，四入水點順序放入水中，記錄小鼠在2min內(nèi)尋找平臺的時間，如果小鼠在2min內(nèi)找到平臺，記錄2min內(nèi)的逃避潛伏期，如果2min內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留10s，逃避潛伏期記錄為2min。訓(xùn)練小鼠歷時4天。4天訓(xùn)練逃避潛伏期結(jié)束后，次日將水迷宮內(nèi)的平臺移除，讓兩組小鼠從原來平臺所在象限的對側(cè)象限進入水迷宮，用Smart系統(tǒng)測其在5min內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)和小鼠在平臺各個象限停留的時間，以判斷小鼠記憶儲存以及提取再現(xiàn)能力。

1.4 免疫組化

1.4.1 腦片標本制作

將以上跑完水迷宮后的空白組和缺血組小鼠灌注取腦，質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定12 h，依次用質(zhì)量濃度為100 g/L、200 g/L、300 g/L的蔗糖脫水，制作冰凍切片。

1.4.2 免疫組化檢測步驟如下:

選取含海馬區(qū)的冰凍切片于孔板內(nèi)，用PBS溶液沖洗；質(zhì)量濃度為30 g/L的H2O2去離子水室溫孵育5～10min， 消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS(AR,30)沖洗5min，沖洗3次；質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA封閉液 37 ℃孵育30min，甩干。滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜。PBS沖洗，5min×3次；滴加生物素標記IgG，37 ℃孵育30min。PBS沖洗5min，沖洗3次；滴加 SABC，37 ℃孵育30min；PBS沖洗5min，沖洗3次。DAB染色，復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.4.3 Bax，Bcl-2檢測方法

陽性細胞計數(shù)：在200倍光學(xué)顯微鏡下在腦組織海馬區(qū)切片內(nèi)隨機選取5個視野計數(shù)免疫組化染色陽性的細胞數(shù)。并分別記錄每組切片Bax和Bcl-2染色陽性細胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果

2.1.1 空白組在D3、D4逃避潛伏期最短,D5穿越平臺次數(shù)最多，目標象限停留時間最長，空白組小鼠的活動區(qū)域集中于目標象限；與空白組比較, 實驗組D3、D4逃避潛伏期時間延長(P<0.05)、D5穿越平臺次數(shù)減少 (P<0.05)，小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢。其余沒有統(tǒng)計學(xué)意義(目標象限停留時間沒有差異)。(見表1)

表1 小鼠Morris水迷宮數(shù)據(jù)(s)

2.1.2 在空間探索階段，空白組小鼠在目標象限活動路徑長于實驗組，路徑圖呈趨向型搜索策略；實驗組小鼠在各個象限路徑長短沒有差異，呈現(xiàn)邊緣型搜索策略。(見圖1)

圖1 小鼠空間探索階段路徑圖

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.2.1 Bcl-2表達情況 空白組第9天Bcl-2表達量為2.91±2.09，實驗組表達量為26.18±17.52；與空白組相比，實驗組的Bcl-2蛋白表達水平均增加(P<0.05)。

2.2.2 Bax表達情況 空白組第9天Bax表達量為3.97±4.09，實驗組表達量為63.60±12.77；與空白組比較,實驗組的Bax蛋白表達水平增加 (P<0.05)。

空白組Bcl-2/Bax比值為0.92±0.52，實驗組Bcl-2/Bax比值為0.44±0.29，說明Bax在9 d內(nèi)相比Bcl-2表達增幅較大。(見圖2、3)

圖2 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bcl-2表達情況)A空白組；B實驗組

圖3 小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞免疫組織化學(xué)染色×200(Bax表達情況)A空白組；B實驗組

3 討 論

腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腦組織損傷和功能障礙，而海馬區(qū)(學(xué)習(xí)記憶中樞)對缺血較敏感。而Morris水迷宮是利用小鼠尋找水中的休息場所的本能, 通過定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分來測試小鼠對空間位置感和方向感 (空間定位) 的學(xué)習(xí)記憶能力。并且在固定時間進行，選取同年齡同性別小鼠，實驗過程中保持水迷宮之外的一切物品靜止，以達到盡量減少外部因素對實驗數(shù)據(jù)的干擾的目的[7],本實驗用Morris水迷宮的定位航行試驗，對比實驗組(缺血再灌注小鼠)與空白組(未做任何處理的正常小鼠)的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮實驗結(jié)果顯示，與空白組比較, 實驗組小鼠逃避潛伏期時間延長、穿臺次數(shù)減少(P<0.05)，實驗組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈下降趨勢(P<0.05)。該結(jié)果說明缺血再灌注影響了小鼠的學(xué)習(xí)記憶，缺血再灌注模型制作成功。

有研究表明，細胞凋亡是造成小鼠大腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元丟失的重要原因[8]，而且神經(jīng)元的凋亡會加重再灌注后對海馬區(qū)的損傷。Bcl-2、Bax基因調(diào)控的蛋白在神經(jīng)細胞凋亡過程中起著非常關(guān)鍵的作用。Bcl-2蛋白對細胞凋亡有一定的抑制作用，而Bax蛋白則對細胞凋亡具有一定的促進作用[9]。另外，近年來大量研究提示，Bcl-2家族調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展取決于促進抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制凋亡蛋白Bax的相對濃度[10]，所以Bcl-2/Bax也可以間接地反映細胞凋亡的情況。

本實驗中，未做任何處理的空白組小鼠海馬區(qū)Bax和Bcl-2均有少量表達，實驗組缺血再灌注9天后的小鼠海馬區(qū)Bax、Bcl-2的表達均大幅度提高，并且Bax上升的幅度較Bcl-2大。相關(guān)實驗也表明正常情況下Bcl-2、Bax僅有微弱的表達，而模型組Bcl-2、Bax陽性表達增加[11]。根據(jù)實驗結(jié)果分析，實驗組Bcl-2/Bax比值較空白組降低，表明Bcl-2/Bax的下調(diào)與神經(jīng)細胞的凋亡亦有密切的關(guān)系。他人研究已發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax的比值變化決定細胞的凋亡與生存，比值越高，細胞存活率越高；比值越低，細胞的凋亡率越高[12]，本研究結(jié)果與其相符。

綜上所述，Bax在小鼠缺血再灌注模型中起到促進細胞凋亡的作用，Bcl-2/Bax比值下調(diào)也與細胞凋亡有關(guān)，對小鼠學(xué)習(xí)記憶造成影響。