夏露花，宗 平，王新華，董占飛，崇 樂，秦永德

(新疆醫(yī)科大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，烏魯木齊 830054； b.附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科； c.附屬腫瘤醫(yī)院超聲科，烏魯木齊 830011)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其病死率居各種惡性腫瘤之首，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在肺癌中占80%[1]。NSCLC包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌，其癌細(xì)胞生長分裂緩慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移較晚：因此，盡管在當(dāng)今發(fā)達(dá)的醫(yī)療科技下，仍有75%左右的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低[2]。付鵬等[3]采用康萊特注射液治療53例中晚期NSCLC，經(jīng)過3年隨訪發(fā)現(xiàn)，患者中位生存時間僅為(18.5±1.6)個月，生存率僅為39.6%(21/53)。POLANSKI等[4]研究表明，由于NSCLC早期診斷率較低，多數(shù)患者確診時已進(jìn)入晚期，其5年生存率僅為15%。李飛等[5]研究顯示，由于大部分NSCLC擴(kuò)散比較早，發(fā)現(xiàn)時已錯失手術(shù)機(jī)會，5年生存率僅為12%～15%。但是，隨著醫(yī)學(xué)工作者對腫瘤分子生物學(xué)的研究，對腫瘤組織中多基因的異常表達(dá)以及癌基因的監(jiān)測分析取得了較大的進(jìn)展[6]。王利偉等[7]對70例舌癌患者研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1 mRNA在舌癌中低表達(dá),且其表達(dá)水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),而與生存時間呈正相關(guān),認(rèn)為監(jiān)測nm23-H1 mRNA的表達(dá)水平對術(shù)后輔助治療有重要意義。而對于NSCLC的研究主要是表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因——nm23等。為此，本研究收集180例NSCLC組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)EnVision法對其進(jìn)行檢測，分析其表達(dá)情況與相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2016年1月至2018年9月間外科手術(shù)切除的NSCLC組織標(biāo)本(研究組)180例，術(shù)前均接受放化療及其他腫瘤治療。其中男107例，女73例，年齡24～77歲，平均(52.36±7.52)歲。鱗癌69例，腺癌111例；高分化癌38例，中分化癌53例，低分化癌89例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移131例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)[8]2009年肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，Ⅰ期37例，Ⅱ期45例，Ⅲ期73例，Ⅳ期25例。收集同期在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院門診體檢的健康體檢者的正常肺組織標(biāo)本(對照組)53例，排除患有嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性疾病和血液疾病、臨床資料不完整及不愿意參與本研究的患者。其中男36例，女17例，年齡25～74歲，平均(50.65±7.87)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑

儀器：CUT 6062型全自動石蠟切片機(jī)、Slidetec HEAT型烤片機(jī)均購自德國LABSUN公司；102M型Motic顯微鏡、攝像裝置均購自德國Motic公司；EPSON STYLUS PHOTO 915型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購自北京航空軟件有限公司；HH.CP-160型CO2培養(yǎng)箱購自常州恒隆儀器有限公司。

試劑：EGFR鼠抗人單克隆抗體、VEGF鼠抗人單克隆抗體和nm23鼠抗人單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)試劑盒、PBS緩沖液、nm23抗體稀釋液、粘片劑POLY-LYSIN均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 檢測方法

將研究組及對照組的組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，制成石蠟標(biāo)本。然后，采用全自動石蠟切片機(jī)連續(xù)切片4 μm，貼附于載片玻璃，烤片機(jī)烘干。冷卻后，脫蠟，逐級脫水，抗原修復(fù)。使用PBS緩沖液沖洗，分別加入EGFR鼠抗人單克隆抗體、VEGF鼠抗人單克隆抗體和nm23鼠抗人單克隆抗體，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后，行蒸餾水沖洗，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察攝像，醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測2組EGFR、VEGF和nm23的表達(dá)水平，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。用已知的NSCLC陽性片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

分析EGFR、VEGF和nm23在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)情況[9]：細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒表示為陽性(+)，根據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行陽性細(xì)胞評分：陽性細(xì)胞數(shù)<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，75%以上為4分，陰性為0分。細(xì)胞染色程度評分[10]：腫瘤細(xì)胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。評分標(biāo)準(zhǔn)：上述兩項之和0分為(-)，1～2分為(+)，3～6分為()，7分及以上為()。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EGFR、VEGF和nm23的表達(dá)

研究組EGFR、VEGF陽性表達(dá)率均高于對照組，nm23陽性表達(dá)率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組和研究組EGFR、VEGF、nm23表達(dá)率的比較

2.2 EGFR、VEGF和nm23表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、腫瘤分化程度的EGFR、VEGF、nm23陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同的病理類型、腫瘤分期VEGF、nm23陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。鱗癌、腫瘤分期為Ⅰ—Ⅱ期EGFR陽性表達(dá)率均低于腺癌、腫瘤分期為Ⅲ—Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EGFR、VEGF、nm23陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 EGFR、VEGF和nm23表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 EGFR、VEGF和nm23的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中EGFR表達(dá)與VEGF表達(dá)、VEGF表達(dá)與nm23表達(dá)均無明顯的相關(guān)性(r=-0.183，P>0.05；r=-0.137，P>0.05)，但EGFR表達(dá)與nm23表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.267，P<0.05)。

3 討論

EGFR是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。激活后，EGFR由單體轉(zhuǎn)化為二聚體，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。有研究[11]顯示，EGFR表達(dá)在許多惡性腫瘤組織中都較高，且這種高表達(dá)或許與患者的預(yù)后有著緊密關(guān)聯(lián)。呼鐵民等[12]對64例腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在腦膠質(zhì)瘤中陽性率較高,且與腦膠質(zhì)瘤惡性程度具有相關(guān)性,可為臨床診療及預(yù)后提供指導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，不同性別和腫瘤分化程度的EGFR陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而EGFR陽性表達(dá)率：鱗癌、Ⅰ—Ⅱ期均低于腺癌、Ⅲ—Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)，這也進(jìn)一步證實了EGFR在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中承擔(dān)著重要的角色。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，其可以通過與血管內(nèi)皮上的相應(yīng)受體結(jié)合來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時可增加血管通透性，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，維持腫瘤的繼續(xù)生長，對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。有研究[13]表明，在正常的肺組織中VEGF陽性率在6.7%以下，而在腫瘤肺組織中則高達(dá)35%～65%。本研究結(jié)果顯示，對照組VEGF陽性表達(dá)率為3.77%，研究組VEGF陽性表達(dá)率為40.56%，其與徐建平等[14]研究的結(jié)果基本一致。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移VEGF陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)，這也進(jìn)一步證實其能夠促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

nm23是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，對腫瘤的轉(zhuǎn)移具有抑制作用，對保護(hù)人體健康具有重要作用[15]。李春成等[15]研究了在乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后中nm23基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在良性腫瘤中nm23呈高表達(dá)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，nm23表達(dá)減弱，并與其呈負(fù)相關(guān)。潘純國等[16]研究了在乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后中nm23基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在良性腫瘤中nm23呈高表達(dá)，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后，nm23表達(dá)減弱，并與其呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，nm23與NSCLC等多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的nm23陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組的陽性率較低，生存>5年組的陽性率較高，提示nm23的表達(dá)與NSCLC的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，預(yù)后呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同的性別、腫瘤分化程度、病理類型、腫瘤分期nm23陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這也提示針對nm23的表達(dá)還需要做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，EGFR、VEGF和nm23在NSCLC中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)。此外，EGFR的表達(dá)還與病理類型、腫瘤分期具有關(guān)聯(lián)，因此，對EGFR、VEGF和nm23進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，有助于提高臨床對腫瘤的病變程度的判斷準(zhǔn)確度，同時對患者治療方案的制定也具有重要作用。