丁 李，王 玲，魯康樂，宋 凱，張春曉

(集美大學水產(chǎn)學院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，福建廈門 361021)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，魚粉作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物飼料的主要蛋白源，其需求量急劇上升[1]，然而由于世界漁業(yè)資源的逐年衰退，導致魚粉的價格居高不下，因此尋找可替代魚粉的優(yōu)質(zhì)的蛋白源成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題之一[2-4]。豆粕含有較高的可消化蛋白質(zhì)，價格低廉，成為替代魚粉的主要植物蛋白源[5]。但是豆粕中含有大量的抗營養(yǎng)因子如蛋白酶抑制劑、凝集素、植酸和抗維生素以及難以消化的碳水化合物等，長期大量食用會對魚、蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道健康造成負面的影響[4、6-7]。因此，有必要研究植物蛋白對養(yǎng)殖動物生理生化的影響。

牛蛙(Ranacatesbeiana)原產(chǎn)于北美洲，在分類學上屬于脊索動物門兩棲綱無尾目蛙科蛙屬，是大型雜食性蛙類[8]，于1959年從古巴引入我國。因其具有生長速度快，適應能力強、肉質(zhì)鮮美、產(chǎn)量高等優(yōu)點，近年來，牛蛙養(yǎng)殖業(yè)在我國南方地區(qū)發(fā)展迅速，成為新興的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[9]。魚粉是牛蛙飼料的重要蛋白源，本實驗室前期研究表明，豆粕可替代80%的魚粉而不影響其生長性能，但當豆粕100%替代魚粉時會顯著降低其生長性能[10]。在此基礎上本實驗進一步研究豆粕部分或完全替代魚粉對牛蛙生長性能、腸道健康、消化酶活性和飼料消化率的影響，以期為牛蛙飼料中植物蛋白的大量使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉為蛋白源，魚油和豆油為主要脂肪源配制基礎飼料，基礎飼料中魚粉的添加水平為44%，以基礎飼料為對照，以豆粕分別代替基礎飼料中50%和100%的魚粉，并添加三氧化二釔作為內(nèi)源指示劑，配制3組等氮等能的試驗飼料，分別記為FM、B1和B2，試驗飼料的原料組成和營養(yǎng)成分見表1。各飼料原料分別粉碎，過60目篩網(wǎng)，所有原料按照配方等比例逐級依次混合，使用水產(chǎn)飼料膨化機制成膨化飼料，20 ℃條件下自然風干至水分約10%，然后保存于-20 ℃冰箱中備用。

表1 試驗飼料配方和營養(yǎng)組成

注：1.每千克維生素混合物含VB110 mg，核黃素8 mg，鹽酸吡哆醇10 mg，VB120.2 mg，VK310 mg，肌醇100 mg，泛酸鈣20 mg，煙酸50 mg，葉酸2 mg，生物素2 mg，VA(50萬IU)400 mg，VD 5 mg，VE(50萬IU)100 mg，乙氧基喹啉150 mg，次粉0.1328 g。2.50%丙酸鈣和50%富馬酸。3.每千克礦物質(zhì)混合物含氯化鉀200 mg，碘化鉀60 mg，硫酸鈷(1%)100 mg，硫酸銅24 mg，硫酸亞鐵400 mg，硫酸鋅174 mg，硫酸錳78 mg，硫酸鎂800 mg，亞硒酸鈉(1%)50 mg，沸石粉3.114 g。

1.2 養(yǎng)殖試驗管理

牛蛙購于廈門市翔安區(qū)某養(yǎng)殖場，為同批次培育的蛙苗。實驗開始前將牛蛙暫養(yǎng)2周，期間投喂基礎飼料。暫養(yǎng)結束后，停飼24 h，挑選大小均勻并且健康的牛蛙[初始平均體重為(40.0±0.3)g]隨機分配到15個玻璃缸內(nèi)(容積為0.7 m×0.5 m×0.4 m)。試驗隨機分為3個組，每組5個重復，每個重復放10只牛蛙。在試驗期間，水溫為(26±3)℃，水位在5 cm左右，養(yǎng)殖周期為30 d。每天飽食投喂2次(8:00和18:00)，投喂前1 h清理玻璃缸并換水。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結束后，停飼24 h，分別對每缸牛蛙計數(shù)并稱重；每個飼料組隨機選取3個玻璃缸進行采樣，剩下的2個玻璃缸繼續(xù)養(yǎng)殖，用于飼料消化率研究。每缸分別取9只牛蛙，用雙毀髓法處死。每只牛蛙解剖后取空腸和回腸，即牛蛙十二指腸和直腸之間的部分，腸壁較厚的前半部分為空腸，腸壁較薄的后半部分為回腸，分別裝入滅菌的凍存管中，迅速放入液氮保存，其中3只牛蛙用于消化酶活性的測定，3只用于相關炎性因子基因表達的測定。剩余3只牛蛙的空腸和回腸各取1 cm放入伯恩溶液中固定，用于腸道切片制作。糞便的收集參考文獻[11]的方法，收集包膜完整的糞便放入-20 ℃的冰箱中保存。

1.4 試驗指標測定

1.4.1 常規(guī)指標分析

飼料和糞便的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、水分的含量測定參考AOAC(2005)的方法進行，粗蛋白采用杜馬斯燃燒定氮法以全自動蛋白質(zhì)分析儀(Elementer rapid N EXCEDD)測定，粗脂肪采用的是索氏抽提法測定，粗灰分采用馬弗爐550 ℃高溫灼燒法測定，水分采用105 ℃恒重法測定；

1.4.2 消化酶測定

淀粉酶、脂肪酶和總蛋白試劑盒購于南京建成生物研究所，蛋白酶試劑盒購于上海盈公生物科技有限公司；飼料和糞便中釔采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES Prodigy7，Leeman，USA)進行測定；飼料和糞便的能量采用全自動氧彈量熱儀(Parr 6300)測定。

1.4.3 腸道組織觀察

從伯恩固定液中分別取出空腸和回腸組織各0.5 cm，用生物組織自動脫水機(KD-TS3A)進行不同濃度酒精脫水，石蠟包埋組織，修整凝固蠟塊，用組織切片機(型號：德國leica公司生產(chǎn)的RM2235切片機)切片，厚度為6 μm；脫蠟后用蘇木精-伊紅(H.E)染色，封片后用正置熒光顯微鏡(Leica DM5500B)觀察測定和拍照。

1.4.4 腸道炎性因子測定

使用Trizol試劑(TaKaRa)分別提取空腸和回腸組織的總RNA，使用TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒將mRNA進行反轉錄；使用SYBR Green RT-PCR試劑盒(TaKaRa)在Thermal cycler (ABI StepOne PlusTM)Applied Biosystems QuantStudio 6&7 系統(tǒng)上進行實時熒光定量，分析腸道組織促炎性因子mRNA(引物序列見表2)表達量的差異。使用β-actin作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算各炎性因子基因的相對表達量。

表2 引物列表

1.5 計算公式

增重率(WG)=(Wf-Wi)/Wi×100%

特定生長率(SGR)=(lnWf-lnWi)×100%/t

飼料效率(FE)=(Wt-Wo)/Wd

攝食率(FR)=Wd/(Wt/2-Wo/2)/t×100%

蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-Wo)/Wp

成活率(SR)=Nf/Ni×100%

式中Wi和Wf分別表示牛蛙初始均重和末期均重，Wp為總蛋白攝入量，Wd為攝入飼料總重，Nf為末蛙數(shù)，Ni為初始蛙數(shù)，t為試驗天數(shù)，Wt為牛蛙終末總重，Wo為牛蛙初始總重。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)處理采用SPASS 22.0軟件進行單因素方差分析處理(one-way ANOVA),若差異顯著，則進行Duncan氏法多重比較，P<0.05時差異顯著，數(shù)據(jù)用平均值±標準差(Mean±SD)表示，柱形圖使用Prism 5軟件繪制。

2 結果

2.1 豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能和飼料利用率的影響

試驗各組成活率均為100%。豆粕替代組(B1和B2)牛蛙的終末均重(FBW)、增重率、特定生長率、飼料效率、蛋白質(zhì)效率顯著低于FM；而FR在B1組顯著高于FM和B2組，F(xiàn)M和B2組之間差異顯著。

表3 豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

2.2 牛蛙對試驗飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率

由表4所示，隨著豆粕替代水平的增加，飼料干物質(zhì)的表觀消化率顯著降低，變化范圍為78%～86%；豆粕替代魚粉后顯著降低了牛蛙的蛋白質(zhì)表觀消化率，但B1和B2組間無顯著差異；能量的表觀消化率隨替代水平的增加顯著降低，變化范圍為79%～86%。

表4 豆粕替代魚粉對牛蛙表觀消化率的影響

2.3 豆粕替代魚粉對牛蛙腸道消化酶活性的影響

本實驗中牛蛙空腸蛋白酶活性在B2組顯著低于FM和B1組，F(xiàn)M和B1組間無顯著差異；而脂肪酶和淀粉酶活性在各替代組之間沒有顯著差異；回腸蛋白酶活性也在B2組最低，其他兩組間無顯著差異；脂肪酶活性在FM組最高，顯著高于B1和B2組；而淀粉酶活性則在FM組顯著低于B1和B2組。

表5 豆粕替代魚粉對牛蛙腸道消化酶的影響(n=3)

2.4 豆粕替代魚粉對腸道形態(tài)學的影響

如表6所示，豆粕替代魚粉顯著影響牛蛙腸道絨毛高度、肌層厚度和柱狀上皮高度。在空腸和回腸，隨著豆粕替代水平的升高，絨毛高度、肌層厚度和柱狀上皮高度都呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。從圖1和圖2看出，F(xiàn)M組腸道絨毛完整，絨毛密集且較長，柱狀上皮排列整齊，無上皮細胞自溶現(xiàn)象發(fā)生；隨著豆粕替代水平的升高，腸壁變薄，腸絨毛變短且稀疏，出現(xiàn)上皮細胞自溶的現(xiàn)象，細胞核排列紊亂，柱狀上皮變窄；特別在B2組上皮細胞自溶現(xiàn)象明顯，細胞核出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，腸絨毛變短且稀疏，柱狀上皮排列不規(guī)則且變薄。

表6 豆粕替代魚粉對牛蛙腸道組織結構的影響(n=3)

圖1 豆粕替代魚粉對牛蛙空腸組織結構的影響Fig.1 Effects of replacement fish meal by soybean meal on the tissue structure for the jejunum of R.castesbeiana1.FM；2.B1；3.B2； V.絨毛；M.肌層；CE.柱狀上皮。下同。

圖2 豆粕替代魚粉對牛蛙回腸組織結構的影響Fig.2 Effects of replacement fish meal by soybean meal on the tissue structure for the ileum of R.castesbeiana

2.6 豆粕替代魚粉對腸道炎性因子基因表達量的影響

圖3顯示，牛蛙空腸炎性因子基因IL-1β、IL-8和IL-17表達量在B2組最高，顯著高于FM和B1組，但后兩者之間沒有顯著差異；炎性因子TNF-α基因表達量隨著豆粕替代水平的升高而顯著升高。從圖4可以看出回腸中IL-1β和IL-17基因的表達量隨著豆粕替代水平的升高而顯著升高，而IL-8和TNF-α基因表達量在B2組都顯著高于FM組，但FM和B1組間差異不顯著。

圖3 豆粕替代魚粉對牛蛙空腸炎性因子基因mRNA表達量影響Fig.3 Effects of replacement fish meal by soybean meal on mRNA expression of inflammatory factor gene for the jejunum of R.castesbeiana1.FM；2.B1；3.B2；數(shù)據(jù)柱形圖中標注小寫字母不同表示差異性顯著(P<0.05)。下同

圖4 豆粕替代魚粉對牛蛙回腸炎性因子基因mRNA表達量影響Fig.4 Effects of replacement fish meal by soybean meal on mRNA expression of inflammatory factor gene for the ileum of R.castesbeiana

3 討論

豆粕作為主要的植物蛋白源已經(jīng)在水產(chǎn)動物飼料中廣泛應用，但與魚粉相比，豆粕的氨基酸并不平衡，并且含有大量抗營養(yǎng)因子，致使養(yǎng)殖動物攝食大量豆粕后生長性能和飼料利用率會受到負面影響[12-13]。本研究結果也發(fā)現(xiàn)，在不配平氨基酸的情況下，豆粕替代50%和100%魚粉顯著降低了牛蛙的生長性能。然而，方衛(wèi)東等[10]的研究結果表明，補充賴氨酸和蛋氨酸后，豆粕替代80%的飼料魚粉而不影響牛蛙的生長性能。在本實驗中，隨著豆粕替代水平的增加，飼料賴氨酸和蛋氨酸逐漸降低，賴氨酸和蛋氨酸是水產(chǎn)動物的必需氨基酸，對魚類的研究表明，飼料賴氨酸和蛋氨酸缺乏會降低其生長性能、飼料利用率和蛋白質(zhì)沉積率，增加死亡率[14]。上述研究結果說明氨基酸平衡是限制牛蛙飼料中豆粕替代魚粉水平的重要因素。眾多研究表明，豆粕替代水平升高會導致銀色黑鯛(Sparidentexhasta)[13]等水產(chǎn)動物攝食率下降。但在本研究發(fā)現(xiàn)B1組的牛蛙攝食率最高，顯著高于B2組和FM組，這與Zhang等[15]對花鱸(Lateolabraxjaponicus)和Taher等[16]對游泳蟹(Portunuspelagicus)的研究結果一致，都隨著豆粕替代水平的升高，攝食率表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

營養(yǎng)物質(zhì)的消化率是評價飼料營養(yǎng)價值的主要指標。一般來說，水產(chǎn)動物對動物蛋白飼料的消化率比對植物蛋白飼料要高[13]。本實驗結果顯示，豆粕替代魚粉顯著降低了牛蛙對飼料干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率，這與對大西洋鱈魚(Gadusmorhua)(24%)[17]、歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)(50%)[18]和高體鰤(Serioladumerili)[19]等的研究結果一致，可能是因為豆粕中含有的抗營養(yǎng)因子降低了飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。另外飼料營養(yǎng)成分的消化率與動物消化道內(nèi)消化酶的活性有關[20]，同時消化酶活性也受飼料組成的影響[21-22]。已有研究表明，豆粕高比例替代魚粉會降低羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[23]、牛蛙[10]和花鱸[15]等養(yǎng)殖動物腸道消化酶活性。本試驗也發(fā)現(xiàn)，豆粕100%替代魚粉顯著降低了牛蛙腸道蛋白酶活性以及回腸脂肪酶活性，其變化趨勢與表觀消化率結果相似，說明飼料中高水平的豆粕會影響牛蛙腸道消化酶的活性，從而降低牛蛙對飼料的表觀消化率。

腸道是水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官。本試驗中，豆粕替代組牛蛙腸絨毛高度，肌層厚度以及柱狀上皮高度都出現(xiàn)降低現(xiàn)象，表明豆粕替代魚粉可能改變了牛蛙腸道組織結構，在大黃魚[24]、建鯉(CyprinuscarpiovarJian)[25]、高體鰤[19]和花鱸[15]的研究中也有相似現(xiàn)象，這可能是由于腸上皮細胞表面的特異性受體與豆粕中的某些抗營養(yǎng)因子結合，導致腸黏膜出現(xiàn)炎癥反應所致。已有研究表明，豆粕抗營養(yǎng)因子凝集素與多糖可能會破壞腸道微絨毛結構，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[26]，而大豆抗原蛋白可以引起魚類腸道炎癥，從而可能影響腸道結構，對腸道健康產(chǎn)生負面影響[27]。在本研究中，隨著豆粕替代水平的增加，牛蛙腸道促炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-8和IL-17表達量顯著增強。在很多魚類研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[28-30]，這說明豆粕可能通過誘導牛蛙腸道炎癥反應，進而導致腸道組織結構改變。

4 結論

在本實驗條件下，50%豆粕替代魚粉即會降低牛蛙的生長性能、飼料利用率及其對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率；高豆粕飼喂牛蛙可誘導其腸道炎癥反應，豆粕誘導的腸道炎性反應可能是損害腸道健康、降低營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要因素。