李 思，劉曉宇，2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070)

有機(jī)磷化合物是殺滅傳染病媒介昆蟲、防治農(nóng)作物病蟲害的有效藥物?，F(xiàn)使用的有200余種，常用的有辛硫磷、毒死蜱、敵敵畏、氧化樂果和敵百蟲等。其中我國生產(chǎn)的有機(jī)磷農(nóng)藥占我國農(nóng)藥總產(chǎn)量的50%以上[1]。目前，環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)其造成的危害已嚴(yán)重制約了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和水產(chǎn)品的出口。辛硫磷作為一種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的清塘和病蟲害防治[2]，施用于田間的辛硫磷還可以通過地表徑流進(jìn)入地表水，造成水體污染[3]。鯽(Carassiusauratusgibebio)是我國重要的大宗淡水魚類之一，位居大宗淡水魚第四位?，F(xiàn)今，國內(nèi)外研究辛硫磷對(duì)水生生物，尤其是對(duì)在我國廣泛養(yǎng)殖的鯽的影響的研究十分不足。

細(xì)胞色素P450是1958年被發(fā)現(xiàn)的，它是一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450 nm處有吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質(zhì)。目前，已知的CYP450酶系主要由血紅素蛋白(P450、b5)、黃素蛋白(NADPH-P450還原酶、NADPH-b5還原酶)和磷脂(主要是磷脂酰膽堿)三種成分組成，共同構(gòu)成一個(gè)電子傳遞體系[4]。細(xì)胞色素P450在同一動(dòng)物的許多不同組織中都存在。對(duì)于脊椎動(dòng)物，CYP450酶含量最豐富的器官一般為肝臟，在腎、皮膚、小腸、肺、腦、消化道、骨髓等組織器官也有分布[5]。CYP3A是CYP450家族中主要的一個(gè)亞族，在肝臟CYP450的含量為30%～40%，占據(jù)第一位，目前已發(fā)現(xiàn)越來越多的藥物由CYP3A催化代謝，且CYP3A還與許多前致癌物和前毒物的代謝活化有關(guān)[6]。CYP3A在魚類研究中應(yīng)用廣泛，其作為一種生物標(biāo)志物，應(yīng)用于環(huán)境生態(tài)學(xué)和毒理學(xué)。目前，已有毒性物質(zhì)，例如咪唑類離子液體[7]、多溴聯(lián)苯醚[8]、銅鎘重金屬[9]等對(duì)魚類CYP3A活性以及基因表達(dá)方面的研究，但是有關(guān)廣泛使用的農(nóng)藥辛硫磷對(duì)其活性以及更深層次的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的研究還存在很大的不足。本研究旨在從酶活性、轉(zhuǎn)錄及翻譯水平研究辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A的影響以及其效應(yīng)相互關(guān)聯(lián)性做初步的探索，為后期更深入探究有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)水生生物的代謝調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用鯽購自武漢鯽養(yǎng)殖場(chǎng)。平均重量為(107±14.2)g。實(shí)驗(yàn)前，將鯽養(yǎng)殖于(50 cm×30 cm×20 cm)的玻璃水箱內(nèi)，養(yǎng)殖用水為充分曝氣除氯后的自來水，馴養(yǎng)一周至穩(wěn)定。增氧機(jī)連續(xù)增氧，每日換水一次并清理缸內(nèi)雜物，溫度控制在(24±2)℃。

1.2 試劑及儀器

99%的辛硫磷分析標(biāo)準(zhǔn)品和紅霉素(E105345)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 還原型輔酶NADPH-Na4(>98%)購自北京索萊寶科技有限公司；動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒、第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×SYBR qPCR Mix(熒光定量)均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；兔多抗CYP3A4(18227-1-AP)購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001)購于杭州賢至生物有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054)購于武漢博士德生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物合成

參照文獻(xiàn)[10]由武漢百捷智生物科技有限公司合成鯽CYP3A引物：F1(5′-CGA CCT TCG CCC TCC ACA G-3′)和 R1(5′-ACC TCA TCC CGA TGC AGT TCC-3′)以及β-actin內(nèi)參基因引物：F2(5′-TCT TTT CCAGCC ATCCTT CCT A-3′)和R2(5′-GGT CAG CAA TGC CAG GGT A -3′)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)[11]，選取0.082 5、0.165、0.330 mg/L(1/40、1/20、1/10的96 h LC50)分別作為實(shí)驗(yàn)組的低、中、高濃度值。對(duì)照組為丙酮助溶劑組。因辛硫磷見光易分解，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程避光進(jìn)行，持續(xù)充氧，不喂食，采用半靜態(tài)染毒法。分別在染毒24、48、72和96 h后，迅速取出鯽肝臟，一部分用于提取RNA，一部分用于提取肝微粒體，提取后立即放入-80 ℃貯存。

1.5 肝微粒體的制備

采用差速離心法制備鯽肝微粒體，方法參照文獻(xiàn)[12]，稍作改動(dòng)。迅速敲擊鯽頭部，昏迷后測(cè)體長、魚重，解剖，立即取出肝臟，用0.1 mol/L，pH 7.4的PBS緩沖溶液反復(fù)漂洗去除紅細(xì)胞，濾紙上除去多余液體后稱重，轉(zhuǎn)入手持式勻漿器，按1∶4(W/V)的比例加入勻漿緩沖液，置冰浴中制成勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入預(yù)冷離心管中，4 ℃條件下，12 000g離心20 min，棄去上層漂浮乳白色脂質(zhì)，取出其余上清液轉(zhuǎn)移至超高速離心管中，4 ℃條件下，15 000g離心60 min，棄上清液，底部粉紅色沉淀即為微粒體組分。按照每克肝加懸浮緩沖液1 mL震蕩混合后，分裝于管中，-80 ℃冰箱貯藏備用。

1.6 蛋白含量的測(cè)定

采用BCA法測(cè)定肝微粒體蛋白總含量。配制BCA 工作溶液，牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)曲，計(jì)算樣品蛋白含量。

1.7 鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的測(cè)定

通過測(cè)定紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性反映CYP3A酶活性，具體方法參照文獻(xiàn)[13]。酶活性以pmol甲醛/(min·mg)蛋白表示。

1.8 CYP3A mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)

利用動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒迅速提取鯽肝臟中的RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260/OD280比值檢驗(yàn)RNA產(chǎn)量和純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR反應(yīng)采用Qtower 2.2(Analytik Jena AG，German)，具體操作參照2×SYBR qPCR Mix試劑盒操作說明進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)次數(shù)40次，溫度以1 ℃/10 s的速率從65 ℃緩慢遞增到95 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。利用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量(ΔCt=目的基因Ct平均值-內(nèi)參Ct平均值；ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt)。

1.9 CYP3A蛋白相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)

利用差速離心法制備的肝微粒體蛋白經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行初步分離，切下目的條帶，通過電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件：GAPDH: 200 mA，90 min；CYP3A4：200 mA，120 min)，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h，用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜(GAPDH：1∶1 000；CYP3A4：1∶1 000)，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶50 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，反應(yīng)數(shù)分鐘待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.10 數(shù)據(jù)分析

以上結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異，則進(jìn)一步采用Duncans test 進(jìn)行檢驗(yàn)比較，當(dāng)P<0.01時(shí)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有極顯著性差異。圖形處理使用GraphPad Prism 5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的影響

辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中的CYP3A酶活性影響見圖1，結(jié)果顯示，辛硫磷對(duì)CYP3A酶活性整體上呈現(xiàn)較為明顯的抑制作用。染毒后24 h和72 h呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨染毒濃度的增加，活性抑制作用愈加明顯，與對(duì)照組相比，染毒后24 h，高濃度組的酶活性降低了29.6%，差異極顯著；染毒后72 h，中、高濃度組酶活性分別降低了25.8%和38.6%，差異極顯著。染毒后48 h，相比對(duì)照組，CYP3A酶活性表現(xiàn)為在低濃度時(shí)受到顯著抑制，而在中、高濃度組間無顯著差異；染毒后96 h無顯著劑量效應(yīng)，低、中濃度組相比對(duì)照組無顯著差異，但在高濃度組間抑制作用明顯，酶活性降低了52.6%。

圖1 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A酶活性的影響(n=3)Fig.1 Effect of phoxim on CYP3A activity in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)“*”表示與同一天的對(duì)照組(0 mg/L)相比差異顯著(P<0.05)；“**”表示與同一天的對(duì)照組(0 mg/L)相比差異極顯著(P<0.01)。圖2、圖3同。

2.2 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中的CYP3A mRNA相對(duì)表達(dá)的影響見圖2，結(jié)果顯示，辛硫磷能降低鯽肝微粒體中的CYP3A mRNA的表達(dá)量。整體上，均不存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，染毒后24 h，相比對(duì)照組，低、高濃度組CYP3A mRNA的下調(diào)作用極顯著，分別下調(diào)了35.9%和65.5%，而在中濃度組染毒時(shí)無顯著差異。染毒后48 h僅在低濃度組時(shí)相較對(duì)照組存在極顯著差異，中、高濃度組無顯著差異。辛硫磷染毒后72 h及96 h，相比各對(duì)照組，各濃度組間都存在極顯著差異，72 h后，低、中、高濃度組CYP3A mRNA表達(dá)分別下調(diào)了81.7%、56.2%、89.4%；96 h后，低、中、高濃度組CYP3A mRNA表達(dá)分別下調(diào)了66.1%、77.2%、73.4%。

圖2 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A mRNA相對(duì)表達(dá)的影響(n=3)Fig.2 Effect of phoxim on CYP3A mRNA expression in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)

2.3 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中蛋白相對(duì)表達(dá)的影響

辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中的CYP3A蛋白表達(dá)量的影響見圖3、圖4，結(jié)果顯示，辛硫磷能降低鯽肝微粒體中的CYP3A蛋白的表達(dá)量，并且在各染毒時(shí)間組中皆呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，辛硫磷濃度越高，表達(dá)量越低。相較其他時(shí)間組，染毒后24 h，CYP3A蛋白表達(dá)量的抑制作用更顯著，低、中、高濃度組的表達(dá)量分別下降了21.8%、42.5%、62.3%；48 h后，相比對(duì)照組，低、中濃度組的蛋白表達(dá)量無顯著差異，但高濃度組存在顯著抑制的現(xiàn)象，表達(dá)量降低了48.9%；染毒后72 h和96 h的情況類似，CYP3A蛋白的表達(dá)量都在中、高濃度組表現(xiàn)為顯著差異，在低濃度染毒時(shí)不存在顯著差異。

圖3 辛硫磷對(duì)鯽肝微粒體中CYP3A蛋白相對(duì)表達(dá)的影響(n=3)Fig.3 Effect of phoxim on CYP3A protein expression in liver microsomes of C.auratus gibebio(n=3)

圖4 辛硫磷暴露下鯽肝微粒體CYP3A及GAPDH的western blot結(jié)果Fig.4 Western blot results of CYP3A and GAPDH in livermicrosomes of C.auratus gibebio exposed to phoxim

3 討論

CYP3A作為占據(jù)CYP450酶含量最多的一類重要亞型，參與眾多內(nèi)、外源性物質(zhì)的代謝和調(diào)控作用，調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能。辛硫磷作為一種在漁業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用的農(nóng)藥，主要用來殺滅漁業(yè)害蟲和魚類寄生蟲，對(duì)高等動(dòng)物低毒，但對(duì)魚類具有一定的毒性[14]?，F(xiàn)階段研究主要集中于辛硫磷對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的神經(jīng)毒性和生殖毒性上。研究顯示不同濃度的辛硫磷會(huì)對(duì)中華稻蝗的乙酰膽堿酯酶(AChE)、酯酶(EST)活性及抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生影響，氧自由基的形成可能是辛硫磷毒性的一個(gè)因素[15]；孟順龍等[16]研究表明辛硫磷對(duì)羅非魚的超氧化物歧化酶活性有顯著抑制效應(yīng)。

本研究顯示，辛硫磷能夠抑制鯽肝微粒體中CYP3A的酶活性、mRNA和蛋白的表達(dá)量，其對(duì)活性的抑制作用與CYP3A mRNA和蛋白的表達(dá)量減少存在一定的關(guān)聯(lián)。不同時(shí)間的辛硫磷染毒對(duì)CYP3A酶活性的抑制程度不同，但在整體上無明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

就CYP3A mRNA的表達(dá)水平與酶活性關(guān)系而言，染毒后48 h的不同濃度組間，24 h和72 h時(shí)的中、高濃度組間，CYP3A的轉(zhuǎn)錄水平及酶活性變化表現(xiàn)為很強(qiáng)的一致性，說明辛硫磷可通過影響CYP3A的mRNA轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)量的減少，最終使得CYP3A的酶活性受到抑制，這與黃連素對(duì)鯽[10]及諾氟沙星對(duì)劍尾魚[17]CYP3A mRNA轉(zhuǎn)錄和酶活性的抑制關(guān)系影響類似。辛硫磷對(duì)鯽肝臟CYP3A轉(zhuǎn)錄水平的影響可能涉及對(duì)動(dòng)物CYP3A轉(zhuǎn)錄調(diào)控PXR(孕烷X受體)代謝途徑的參與。PXR能夠結(jié)合并激活來自多個(gè)物種的CYP3A基因啟動(dòng)子中的特異性反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄[18]。研究表明核受體蛋白PXR會(huì)介導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞[19]、食蚊魚肝臟[20]、海鯛肝細(xì)胞[21]CYP3A基因的轉(zhuǎn)錄。Ding等[22]研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)期間肝細(xì)胞PXR介導(dǎo)的CYP3A的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是通過改變一種或多種PXR蛋白共因子復(fù)合物的磷酸化狀態(tài)，從而激活蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路進(jìn)而抑制PXR的活性。但就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，也存在其他時(shí)間濃度組間mRNA表達(dá)量與酶活性變化不完全同步的現(xiàn)象，這可能是由于鯽體內(nèi)存在其他轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)作用，諸如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARA)、維生素D結(jié)合受體(VDR)、組成型雄烷受體(CAR)等參與動(dòng)物肝臟CYP3A的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[23]。

就CYP3A mRNA的表達(dá)水平與其蛋白表達(dá)量關(guān)系而言，基本不存在相一致的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這可能是因?yàn)樘囟ɑ虻膍RNA豐度不一定與其翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達(dá)量呈線性關(guān)系，基因表達(dá)的調(diào)控除了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，還存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯，過程中的mRNA的降解、蛋白的降解等因素都可能導(dǎo)致mRNA豐度與蛋白表達(dá)水平不一致[24]。CYP3A蛋白的表達(dá)水平基本呈現(xiàn)較強(qiáng)的劑量與時(shí)間效應(yīng)，并且CYP3A蛋白的表達(dá)量在24、72和96 h染毒后與其酶活性的影響基本一致，這說明辛硫磷對(duì)CYP3A酶活性的影響與其最終的蛋白表達(dá)量有關(guān)，但在48 h后兩者存在負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象，這可能是由于在此期間存在蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的作用。諸如磷酸化、硝基化、泛素化等蛋白質(zhì)翻譯修飾作用都會(huì)對(duì)CYP450酶的活性產(chǎn)生影響[25]。關(guān)于辛硫磷對(duì)鯽肝臟CYP3A表達(dá)中可能涉及到轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的代謝通路的變化及蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用的影響有待后續(xù)深入研究。