周劍光，蔣艷琳，張 林，王昱斌，張 濤，阿達(dá)可白克·可爾江，郭 焱，楊天燕

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，武漢 430223；2.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；3.新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所，烏魯木齊 830000)

江鱈(LotalotaLinnaeus)，別名山鯰魚、山懷子，隸屬鱈形目(Gadiformes)鱈科(Gadidae)江鱈屬Lota。江鱈屬于北極淡水區(qū)系復(fù)合體的魚類，也是鱈科魚類中唯一的淡水經(jīng)濟(jì)種，廣泛分布于北緯45度以北的歐洲、亞洲以及北美洲的內(nèi)陸水域，在我國僅分布于東北的黑龍江水系、鴨綠江上游以及新疆的額爾齊斯河[1-2]。作為高寒水域冷水性珍稀魚類，江鱈因其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高，常被視為美味佳肴，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值、藥用價值和特殊的科學(xué)研究價值[3-5]。

由于江鱈的自然產(chǎn)量較低且市場消費需求較大，近年來過度捕撈及自然環(huán)境改變，導(dǎo)致天然水域江鱈個體趨于低齡化和小型化，且群體數(shù)量減少、分布范圍縮小、遺傳多樣性降低，已列入《中國珍稀野生動物名錄》和《黑龍江省地方重點保護(hù)野生動物名錄》[6]。目前關(guān)于江鱈的研究主要涉及形態(tài)測定、繁殖發(fā)育以及遺傳變異等方面[7-11]，而對其染色體的研究國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。存在于細(xì)胞核中的染色體是生物遺傳物質(zhì)的主要載體，也是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容[12]。研究魚類染色體及其核型，不僅有助于分析魚類遺傳變異與組成、發(fā)育機(jī)制以及系統(tǒng)演化等方面的全方位深入了解，也可以對種間雜交和多倍體育種進(jìn)行預(yù)測與鑒定[13]。因此，開展江鱈這一珍稀冷水魚類的染色體核型分析研究，不僅對其種質(zhì)資源的判別鑒定具有重要意義，也可為其生殖繁衍和人工育種提供理論依據(jù)。本研究對新疆額爾齊斯河流域的野生江鱈染色體核型進(jìn)行測定和分析，研究結(jié)果將有助于補(bǔ)充江鱈細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)信息，同時也為我國高寒水系的魚類遺傳育種及人工繁殖提供參考資料。

1材料與方法

1.1 試驗材料

江鱈于2017年7月采自新疆額爾齊斯河水系的布爾津河流域(圖1)，選取成熟健壯、體表完好、體質(zhì)良好的活體試驗樣品54尾。用直尺和游標(biāo)卡尺測量樣品體長、頭長、體高、頭高、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長、尾柄高，精確至 0.1 cm；用電子天平測量樣品體質(zhì)量，精確至 0.1 g。測得樣品體長在20.3～56.1 cm之間，單尾體質(zhì)量在230.0～1 860.0 g之間。用于江鱈染色體制備的10尾(5雌5雄)樣品于2018年2月采自新疆額爾齊斯河水系的布爾津河流域，單尾體質(zhì)量在80.5～151.6 g之間。

圖1 采樣地點圖(▲為采樣點)Fig.1 Sampling location of L.lota

1.2 染色體標(biāo)本制備

染色體標(biāo)本制備采用林義浩[14]的體內(nèi)注射腎細(xì)胞法，稍作修改，方法如下：(1)實驗前先將江鱈暫養(yǎng)于水族箱中，使水溫以及pH值保持在適宜范圍，將氣石與過濾棉放置于缸內(nèi)，確保溶氧量充足和水質(zhì)干凈。(2)注射PHA(植物血球凝集素)：自實驗魚胸鰭基部注射PHA,劑量10～15μg/g(魚體質(zhì)量)。(3)注射秋水仙素：注射PHA 20～24 h后，每1 g魚體質(zhì)量注射3～5μg秋水仙素。(4)制備細(xì)胞懸液：注射秋水仙素2～4 h后，剪開江鱈的鰓部動脈，放血20 min，取江鱈頭腎,用生理鹽水反復(fù)洗滌3～4次，將組織剪碎、過濾細(xì)胞懸液，再放入離心管中，以1 200 r/min離心10 min，得到沉淀的江鱈頭腎細(xì)胞。(5)低滲處理：往離心管加入5 mL的0.075 mol/L的KCl低滲液，低滲處理50～60 min，再以1 200 r/min的速率離心10 min。(6)固定處理：將預(yù)冷新配的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸 = 3∶1)，量取5 mL加入到剛棄去上清液的沉淀細(xì)胞中，用吸管吹打均勻，固定20 min后再以1 200 r/min的速率離心10 min。再重復(fù)固定2次，每次20 min。(7)滴片處理：將細(xì)胞懸浮液滴于預(yù)冷載玻片上，隨后將載玻片在酒精燈上過火2～3次后放置透風(fēng)透氣處自然風(fēng)干。(8)染色處理：將風(fēng)干的染色體玻片放入濃度為10%吉姆薩(Giemsa)染色液中染色30 min，用蒸餾水將玻片反面沖洗干凈，自然風(fēng)干后鏡檢。

1.3 染色體眾數(shù)確定及組型分析

染色體眾數(shù)確定及組型分析參照TAN等[15]方法進(jìn)行，稍加修改，方法如下：

1.3.1 染色體眾數(shù)確定

選取來自不同個體的110個分散良好的細(xì)胞，用顯微鏡(油鏡)進(jìn)行觀察、拍照，根據(jù)眾數(shù)確定江鱈二倍體染色體數(shù)目。

1.3.2 組型分析

挑選 10個數(shù)目完整、分散良好、長度適中(正中期)、著絲點清楚、2條染色單體適度分開、形態(tài)清晰的分裂相進(jìn)行顯微攝影，在相片上對每一條染色體確認(rèn)著絲點位置，分別測量長臂和短臂，測量數(shù)據(jù)取其平均值。計算其相對長度、臂比值和著絲點指數(shù)，并按LEVAN等[16]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對、分類、排列組型。

2 結(jié)果

2.1 江鱈形態(tài)特征

2.1.1 外形

江鱈外部形態(tài)見圖2所示。江鱈體圓長形，后部側(cè)扁。頭稍扁平。體背部及體側(cè)上部灰褐色，腹部灰白色，體側(cè)與鰭條上散布不規(guī)則的黃白色斑點。吻鈍，口端位。下頜略長于上頜。眼小，眼間距平寬。頦部正中具頦須1枚，兩鼻孔分離，前鼻管突出，具鼻須1對。鰓蓋膜分離，不與峽部相連。體被小圓鱗。側(cè)線前部較高，后部側(cè)中位，且常不完全。背鰭兩個，前背鰭短小，后背鰭基長幾與尾鰭相接。胸鰭扇形。腹鰭喉位，第1～2鰭條略延長呈絲狀。臀鰭基起點稍后于背鰭，后端與尾鰭相接或稍分離。尾鰭橢圓形。

圖2 江鱈外部形態(tài)圖Fig.2 Morphological characteristic of L.lota

2.1.2 可數(shù)性狀

江鱈背鰭鰭式：D.i～iii-10～13，i～ii-65～92；胸鰭鰭式：P.i-16～17；腹鰭鰭式：V.0-7；臀鰭鰭式:A.0-64～84；左側(cè)第一鰓弓外側(cè)鰓耙數(shù)：8～12。

2.1.3 可量性狀

測量了54尾體長20.3～56.1 cm江鱈的體長、頭長、體高、頭高、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高數(shù)據(jù)，其可量性狀比值見表1。

表1 江鱈可量性狀比值

2.1.4 內(nèi)部構(gòu)造特征

江鱈鰾一室，前端分小叉，后部稍大。脊椎骨總數(shù)為58～67。腹膜銀白色。

2.2 體長和體質(zhì)量關(guān)系

分析江鱈體長和體質(zhì)量回歸曲線呈冪函數(shù)關(guān)系(圖3)，額爾齊斯河江鱈體長與體質(zhì)量關(guān)系符合指數(shù)增長形式，二者關(guān)系可用公式W=0.016L2.782(R2=0.960)表示。式中W為體質(zhì)量(g) ，L為體長(cm)。根據(jù)回歸方程將各齡魚的逆算平均體長代入體長-體質(zhì)量關(guān)系式，求得各齡魚平均體質(zhì)量范圍為：2齡魚體質(zhì)量48.2～530.3 g、3齡魚體質(zhì)量62.0～678.2 g、4齡魚105.2～935.6 g、5齡魚238.5～1 675.5 g。

圖3 江鱈體長與體質(zhì)量關(guān)系Fig.3 Relationships between body length(L)and body weight(W)of L.lota

2.3 江鱈染色體數(shù)目和核型

2.3.1 江鱈二倍體染色體數(shù)目

統(tǒng)計10尾江鱈共110個染色體中期分裂相的結(jié)果(表2)，其中染色體總數(shù)為48的分裂相細(xì)胞占全部計數(shù)細(xì)胞的74.5%，由此確定江鱈的二倍體染色體數(shù)目為2n=48(圖4)。

表2 江鱈染色體數(shù)目的分布

圖4 江鱈染色體中期分裂相圖譜Fig.4 Metaphase chromosome of L.lota

2.3.2 江鱈的染色體組型

根據(jù)對江鱈染色體相對長度和臂比的統(tǒng)計結(jié)果(表3)，其全部48條染色體可配成24對，按LEVAN等[16]命名法分成 4組，m組(中部著絲點染色體，r=1.00～1.70)6對；sm組(亞中部著絲點染色體，r=1.71～3.00)9對；st組(亞端部著絲點染色體r=3.01～7.00)7對；t組(端部著絲點染色體，r=7.01～∞)2對。其相對長度最長可以達(dá)到6.83±0.31，而最短為2.06±0.17。按相對長度排列，制成江鱈染色體組型圖(圖5)，核型公式為 2n=12m+18sm+14st+4t，臂數(shù)(NF)=78。從圖5可以看出，在江鱈的m組中，有一對相對本組其他染色體明顯較大的染色體，除此之外，各相鄰兩對染色體之間無明顯差異，大小呈遞減趨勢排列。4組染色體均未發(fā)現(xiàn)帶有特殊標(biāo)志性特征如隨體、次縊痕的染色體，也未發(fā)現(xiàn)與性別決定有關(guān)的異形性染色體。

圖5 江鱈染色體核型Fig.5 Karyotype of L.lota

序號相對長度臂比著絲粒指數(shù)染色體類型16.83±0.311.13±0.0146.99±0.24m25.00±0.211.47±0.0340.54±0.48m34.64±0.791.37±0.1742.18±2.86m44.05±0.281.54±0.0339.39±0.49m53.91±0.221.23±0.1544.91±2.89m63.85±0.281.35±0.0442.54±0.78m75.27±0.402.32±0.0330.13±0.28sm85.23±0.392.14±0.0131.81±0.05sm95.01±0.072.49±0.0228.63±0.17sm104.38±0.022.12±0.0732.05±0.73sm114.29±0.182.01±0.0533.18±0.53sm124.20±0.582.69±0.0627.07±0.43sm133.77±0.222.13±0.1531.98±1.49sm143.64±0.142.05±0.0132.81±0.15sm153.62±0.112.11±0.0732.19±0.73sm164.36±0.203.22±0.1123.68±0.59st174.34±0.164.10±0.0719.61±0.25st183.93±0.253.52±0.1422.14±0.71st193.74±0.134.14±0.0319.44±0.10st203.74±0.233.39±0.0922.76±0.46st213.44±0.233.44±0.0822.50±0.40st223.29±0.374.13±0.0919.48±0.33st233.42±0.15∞∞t242.06±0.17∞∞t

注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

3 討論

按照魚類體長-體質(zhì)量關(guān)系曲線方程，當(dāng)a值越大時魚體越肥碩；b值大于或小于3時，魚類呈異速生長[17]。通過實測數(shù)據(jù)分析，本研究中江鱈體長-體質(zhì)量關(guān)系式中冪指數(shù)值小于3(b=2.782)，表現(xiàn)出體長增長快于體質(zhì)量增長的異速生長，且推算出的1～2齡魚體長、體質(zhì)量的相對增長率均高于性成熟時的3～4齡魚，表明江鱈在性成熟前生長速度相對較快，而性成熟后各項指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢，增長變緩，符合一般魚類的生長規(guī)律[18-19]。不同地理分布區(qū)內(nèi)的江鱈形態(tài)特征存在一定差異。Hubbs等[20]最早提出將江鱈分為江鱈指名亞種(L.lotalota)、細(xì)尾江鱈亞種(L.lotaleptura)和北美斑江鱈亞種(L.lotamaculosa)三個亞種，并將胸鰭長度作為指名亞種區(qū)分其他兩個亞種的分類特征。按照該標(biāo)準(zhǔn)，新疆額爾齊斯河江鱈被劃為指名亞種，而黑龍江流域的江鱈系統(tǒng)分類地位尚不明確，或許處于指名亞種的邊緣[21]。張俊麗等[11]通過對分布于黑龍江多布庫爾河和新疆額爾齊斯河的江鱈形態(tài)特征比較研究發(fā)現(xiàn)，38項量度特征和分節(jié)特征中有28項達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)、26項達(dá)到差異極顯著水平(P<0.01)，從而進(jìn)一步證實了二者可能屬于不同亞種。

染色體與核型分析對研究魚類遺傳和進(jìn)化具有至關(guān)重要的意義。化石證據(jù)和分子遺傳學(xué)資料顯示，作為世界上唯一在淡水中分布的鱈形目魚類，早在5～15百萬年前江鱈就已存在于歐洲的天然水域，并隨后擴(kuò)散到北美各大水系[22]。Ohno[23]研究認(rèn)為，具有48條單臂染色體核型的魚類是硬骨魚類中較原始的類群，物種的核型演化主要通過染色體重排(Chromosomal rearrangement)進(jìn)行。例如，有研究證實染色體臂間倒位(Pericentric inversions)在三刺魚(Gasterosteusaculeatus)對淡水生存環(huán)境適應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用[24]，推測江鱈染色體結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過程中可能也經(jīng)歷了一系列融合、倒位和重組變化，通過增加其染色體臂數(shù)以適應(yīng)淡水生活。

已有的研究表明，二倍體鱈科(Gadidae)魚類染色體數(shù)目從寬突鱈屬(Eleginus)的13對到平頭鱈(Ranicepsraninus)、細(xì)長臀鱈(Trisopterusminutus)和江鱈(L.lota)的24對不等，染色體臂數(shù)也有NF=48和NF=78之別[25]。李樹深[26]通過研究發(fā)現(xiàn)，利用著絲粒染色體和臂數(shù)數(shù)目可以劃分不同魚類類群，具有較多的端部著絲粒染色體的魚類屬于原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的魚類則屬于特化類群，染色體臂數(shù)多的類群較之臂數(shù)少的類群更為特化。通過觀察比較得知，江鱈的染色體臂數(shù)較其他鱈科魚類數(shù)量多，且具有較多中部與亞中部著絲粒染色體，推測江鱈可能是鱈科魚類中較晚分化出來的，在進(jìn)化上屬于較為特化的類群。另外，按照腹鰭著生的位置對應(yīng)魚類在進(jìn)化中出現(xiàn)的先后順序與物種的地位，腹鰭腹位的魚類屬于較原始的類群，而腹鰭胸位和腹鰭喉位在魚類進(jìn)化中出現(xiàn)相對較晚，與之對應(yīng)的魚類進(jìn)化更完善，并且這些特征的出現(xiàn)增強(qiáng)了相應(yīng)物種對環(huán)境的適應(yīng)性，較之腹鰭腹位這一早期形式更高級[19]。因此，該角度也從一個側(cè)面印證了江鱈在進(jìn)化上更為特化。