管 敏，張德志，王 龍，班文波，張厚本，郭柏福，姜 偉

( 中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)有限公司 中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443100 )

中華鱘(Acipensersinensis)為大型溯河產(chǎn)卵洄游性魚類，屬國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。作為變溫動(dòng)物，水溫是影響中華鱘正常生長(zhǎng)和代謝的重要環(huán)境因子之一。中華鱘的最適生長(zhǎng)溫度為14～23 ℃[1]，在其生活環(huán)境中，經(jīng)常出現(xiàn)由季節(jié)更替、氣候變化及人為因素等導(dǎo)致水溫出現(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的溫度降低[2]，從而對(duì)其造成一定程度的低溫脅迫。低溫脅迫可以對(duì)魚類的行為[3]、營(yíng)養(yǎng)代謝[4]、血液指標(biāo)[5-6]、抗氧化能力[7]、免疫[8-9]、消化能力[5]等產(chǎn)生影響。當(dāng)?shù)蜏孛{迫的強(qiáng)度在魚體耐受范圍內(nèi)時(shí)，機(jī)體會(huì)通過自我調(diào)節(jié)適應(yīng)低溫環(huán)境；當(dāng)?shù)蜏孛{迫的強(qiáng)度超出魚類承受能力時(shí)，魚體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將發(fā)生不可逆的改變，最終導(dǎo)致其死亡[10]。因此，研究急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘的影響對(duì)其物種保護(hù)具有非常重要的實(shí)際意義。

在中華鱘物種保護(hù)研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者做了大量工作。1983年，野生中華鱘的人工繁殖技術(shù)獲得突破，并形成一定數(shù)量的子一代中華鱘群體[11]，并于2009年獲得初具數(shù)量規(guī)模的子二代中華鱘群體[12]。子二代中華鱘與子一代存在較明顯的種質(zhì)差異，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)慢[13]、抗逆性差和遺傳多樣性丟失[14]等。這與繁殖親本不同性質(zhì)的生活環(huán)境有關(guān)，子一代中華鱘親本與野生親本相比，其生存于純淡水養(yǎng)殖環(huán)境中，無法進(jìn)行江海洄游，缺少在海洋中生長(zhǎng)育肥的階段[13]。目前，環(huán)境脅迫對(duì)中華鱘影響研究的對(duì)象均為子一代中華鱘，主要集中在饑餓脅迫[15]、擁擠脅迫[15]、漸變溫度脅迫[16-18]、氨氮和亞硝態(tài)氮的急性脅迫[19]等方面，而關(guān)于急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘抗氧化、免疫及消化能力影響的研究未見報(bào)道。筆者通過對(duì)子二代中華鱘進(jìn)行急性低溫脅迫，探究其抗氧化指標(biāo)、免疫指標(biāo)及消化酶活性對(duì)急性低溫脅迫的響應(yīng)，以期為子二代中華鱘的人工養(yǎng)殖、運(yùn)輸和放流提供重要的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚為中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中華鱘。隨機(jī)挑選規(guī)格一致、體質(zhì)健康的子二代中華鱘27尾[體質(zhì)量(1.72±0.33) kg，全長(zhǎng)(74.40±5.80) cm]，并將其暫養(yǎng)于直徑4.0 m的養(yǎng)殖池中，暫養(yǎng)水體溫度23.0 ℃、溶解氧6.0～7.0 mg/L、pH 7.3～7.6、氨氮0.01 mg/L、亞硝態(tài)氮0.005 mg/L。每日飽食投喂1次(投喂量為魚體質(zhì)量1%)，暫養(yǎng)3 d后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)開始前1 d停止投喂。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在3個(gè)直徑4.0 m、水深0.8 m的試驗(yàn)池中進(jìn)行，試驗(yàn)池水溫分別設(shè)置為23、17 ℃和11 ℃，其中，23 ℃組為常溫對(duì)照組，17 ℃組和11 ℃組為低溫脅迫組，每個(gè)溫度組9尾魚，設(shè)3個(gè)平行對(duì)照組。具體試驗(yàn)方法為：使用循環(huán)水系統(tǒng)的制冷機(jī)將試驗(yàn)池中的水溫由23.0 ℃降至設(shè)定溫度后，將試驗(yàn)魚由23 ℃暫養(yǎng)水體中分別直接轉(zhuǎn)至水溫為17 ℃和11 ℃的試驗(yàn)池中，低溫脅迫2 h后取樣；23 ℃組作為常溫對(duì)照組，也采取相同的人為操作方法將試驗(yàn)魚由23 ℃暫養(yǎng)池中轉(zhuǎn)至水溫為23 ℃的試驗(yàn)池中，2 h后取樣。在整個(gè)轉(zhuǎn)魚過程中，為了最大限度減少人為操作對(duì)試驗(yàn)魚造成的應(yīng)激反應(yīng)，試驗(yàn)魚的轉(zhuǎn)移采用轉(zhuǎn)運(yùn)箱帶水轉(zhuǎn)移的方法。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每30 min校調(diào)一次溫度，維持溫差在±0.5 ℃。

1.3 樣品采集和處理

采集27尾子二代中華鱘血液、肝臟、胃及腸道樣品；每尾魚取25～35 mL血液，采集18份肝臟組織、6份胃組織和6份腸道組織樣品。取樣前，用120 mg/L MS-222將魚進(jìn)行麻醉，然后抽血，離心后將上層血清分裝于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70 ℃保存待測(cè)。將試驗(yàn)魚解剖，取肝臟、胃和腸道并經(jīng)預(yù)冷的0.65%的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水后，切成約0.5 g的組織塊，取3～4個(gè)組織塊裝于2 mL離心管中，每個(gè)離心管為1份樣品，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70 ℃保存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、總抗氧化能力活性、谷胱甘肽含量、丙二醛含量；免疫指標(biāo)包括溶菌酶活性和免疫球蛋白M含量；消化酶指標(biāo)包括淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶。所有指標(biāo)的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析和Duncan′s多重比較檢驗(yàn)低溫脅迫對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)影響的顯著性，以P<0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘抗氧化指標(biāo)的影響

急性低溫脅迫2 h，雖未導(dǎo)致子二代中華鱘直接死亡，但對(duì)其抗氧化指標(biāo)已產(chǎn)生顯著影響(表1)。子二代中華鱘血清超氧化物歧化酶活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢(shì)，11 ℃組和17 ℃組差異顯著(P<0.05)；血清過氧化氫酶活性顯著降低(P<0.05)；血清總抗氧化能力活性顯著增加，23 ℃組與17、11 ℃組差異顯著(P<0.05)；各溫度組血清谷胱甘肽和丙二醛含量均為11 ℃組>23 ℃組>17 ℃組(P>0.05)。

表1 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘血清抗氧化指標(biāo)的影響

注：不同字母表示不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，下同.

子二代中華鱘肝臟超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和總抗氧化能力活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢(shì)(表2)。其中，11 ℃組肝臟超氧化物歧化酶活性與17、23 ℃組差異顯著(P<0.05)，17 ℃組肝臟過氧化氫酶活性與11、23 ℃組均差異顯著(P<0.05)，各組肝臟總抗氧化能力活性差異不顯著(P>0.05)；肝臟谷胱甘肽含量顯著下降(P<0.05)，而肝臟丙二醛含量顯著增加(P<0.05)。

2.2 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘免疫指標(biāo)的影響

隨著水溫驟降幅度的增大，血清和肝臟溶菌酶活性均呈先升后降的趨勢(shì)(圖1)，其中，各溫度組血清溶菌酶活性差異顯著(P<0.05)，17 ℃組肝臟溶菌酶活性顯著高于11 ℃組和23 ℃組(P<0.05)。

表2 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘血清和肝臟的免疫球蛋白M含量均呈逐漸遞減的趨勢(shì)，但各組間差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

2.3 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘消化酶活性的影響

急性低溫脅迫2 h，對(duì)子二代中華鱘消化酶活性產(chǎn)生顯著影響。隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘胃淀粉酶、腸淀粉酶和肝臟淀粉酶活性持續(xù)下降(圖3)，且23 ℃組胃淀粉酶、腸淀粉酶和肝臟淀粉酶活性與11 ℃組均差異顯著(P<0.05)。在同一水溫組中，腸淀粉酶活性顯著低于胃淀粉酶和肝臟淀粉酶活性(P<0.05)。

圖1 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘血清和肝臟溶菌酶活性的影響不同字母代表中不同溫度組之間差異顯著(P<0.05),下同.圖2 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘血清和肝臟免疫球蛋白M含量的影響

圖3 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘淀粉酶活性的影響不同小寫字母表示相同組織不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示相同溫度不同組織之間差異顯著(P<0.05)，下同.

子二代中華鱘肝臟脂肪酶活性顯著高于胃、腸(P<0.05)(圖4)。水溫驟降顯著提高胃和肝臟的脂肪酶活性(P<0.05)，但對(duì)腸脂肪酶活性影響不顯著(P>0.05)。

圖4 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘脂肪酶活性的影響

子二代中華鱘胃組織的胃蛋白酶活性顯著高于腸道和肝臟(P<0.05)(圖5)。由此可見，在比較急性低溫脅迫對(duì)魚體胃蛋白酶活性影響時(shí)，可忽略肝臟和腸道中的胃蛋白酶，直接選用胃組織中胃蛋白酶的活性變化來代表魚體胃蛋白酶的活性變化。本試驗(yàn)中，水溫驟降2 h顯著降低了魚體胃蛋白酶的活性(P<0.05)，且胃蛋白酶的活性隨水溫驟降幅度的增大呈先降后升的趨勢(shì)(P<0.05)，但11 ℃組胃蛋白酶活性仍顯著低于23 ℃組(P<0.05)。

圖5 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘胃蛋白酶活性的影響

3 討 論

3.1 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘抗氧化能力指標(biāo)的影響

生物體內(nèi)存在可清除過多活性氧自由基的抗氧化防御體系，主要包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，其中，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶就是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶[20]，二者相互關(guān)聯(lián)，可聯(lián)合清除活性氧自由基，其活性的下降標(biāo)志著機(jī)體清除活性氧自由基的能力下降[21]。本研究中，隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘血清、肝臟的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這與銀鯧(Pampusargenteus)幼魚[22]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚[23]的研究結(jié)果相同。這表明，當(dāng)水溫由23 ℃驟降至17 ℃時(shí)，魚體可以通過提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性來應(yīng)對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)的影響；但當(dāng)驟降溫差增至12 ℃時(shí)，11 ℃組血清和肝臟的超氧化物歧化酶活性顯著低于17 ℃組，說明12 ℃的驟降溫差已對(duì)魚體內(nèi)抗氧化酶活性產(chǎn)生顯著的抑制作用，而劉奇奇[24]分析認(rèn)為，這不僅與酶活力下降有關(guān)，還與溫度驟降導(dǎo)致酶合成途徑受阻有關(guān)。

谷胱甘肽是一種低分子活性氧自由基清除劑[25]，是清除活性氧自由基非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)[26]。本試驗(yàn)中，子二代中華鱘肝臟谷胱甘肽含量隨水溫驟降溫差的增大呈先降后升的趨勢(shì)，這與超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性變化趨勢(shì)相反，推測(cè)其原因?yàn)楣入赘孰氖枪入赘孰倪^氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶分解過氧化氫所必需的底物[26]，水溫驟降直接影響谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，從而間接影響谷胱甘肽的含量。銀鯧幼魚[22]的研究結(jié)果證實(shí)了這一推測(cè)，當(dāng)溫度自27 ℃驟降至22 ℃時(shí)，銀鯧幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性在0～12 h內(nèi)顯著下降。

總抗氧化能力的大小是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)，它可以反映機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外來脅迫的能力[27]。馮廣朋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在水溫恒定的條件下，20 ℃組子一代中華鱘幼魚總抗氧化能力活性高于15 ℃組、25 ℃組和30 ℃組，分析認(rèn)為，由于魚類在低溫和高溫條件下，機(jī)體內(nèi)活性氧自由基增多導(dǎo)致防御體系的抗氧化物質(zhì)不斷減少引起的。本研究中，水溫驟降顯著增加子二代中華鱘血清總抗氧化能力活性，說明魚體針對(duì)低溫脅迫已開啟自我保護(hù)機(jī)制；11 ℃組中血清總抗氧化能力顯著高于23 ℃組(P<0.05)，這可能是因?yàn)楫?dāng)魚體抗氧化酶促反應(yīng)體系受抑制時(shí)，非酶促反應(yīng)體系(如氨基酸、維生素、金屬蛋白質(zhì)等)應(yīng)對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的的結(jié)果。此外，11 ℃組肝臟總抗氧化能力含量與其他兩組相比不升反降，這與四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)幼魚[24]在水溫驟降12 ℃脅迫2 h時(shí)的結(jié)果相同。

丙二醛是活性氧自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，它可以反映細(xì)胞受活性氧自由基攻擊的程度，從而間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱及組織細(xì)胞受損傷的嚴(yán)重程度[22,25]。試驗(yàn)結(jié)果表明，子二代中華鱘血清丙二醛含量隨水溫驟降幅度的增大呈先降后升的趨勢(shì)，但各組之間差異不顯著(P>0.05)；而肝臟丙二醛含量隨驟降溫差的增大而急劇增加(P<0.05)，分析認(rèn)為急性低溫脅迫造成魚體產(chǎn)生大量活性氧自由基，抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)無法清除過量的活性氧自由基，使得活性氧自由基不斷攻擊肝臟細(xì)胞產(chǎn)生大量丙二醛，這間接反映了急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘的肝臟造成了一定程度的損傷。這與四指馬鲅幼魚的研究結(jié)果相同[24]，即當(dāng)水溫由27 ℃驟降至15 ℃并脅迫2 h時(shí)，其肝臟已受到較為嚴(yán)重的損傷，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡化、肝板結(jié)構(gòu)混亂、肝血竇間隙收縮及肝細(xì)胞整體染色加深。

3.2 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘免疫指標(biāo)的影響

溶菌酶是魚體非常重要的免疫因子，其活性與水溫、鹽度、細(xì)菌等環(huán)境因子密切相關(guān)[28]。在急性應(yīng)激條件下，魚體血清中溶菌酶活性會(huì)顯著增加[29]。本研究中，子二代中華鱘血清、肝臟的溶菌酶活性隨水溫驟降幅度增大均呈先升后降的趨勢(shì)，即當(dāng)水溫由23 ℃驟降至17 ℃時(shí)，子二代中華鱘血清、肝臟溶菌酶活性增加，說明魚體通過提高溶菌酶活性來增強(qiáng)自身非特異免疫的能力，以應(yīng)對(duì)低溫驟降帶來的不利影響，這與孫學(xué)亮等[30]的報(bào)道結(jié)果類似；但當(dāng)水溫由23 ℃驟降至11 ℃時(shí)，血清、肝臟溶菌酶活性與17 ℃組相比顯著下降，這表明，溫差達(dá)12 ℃顯著降低了魚體溶菌酶活性，對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這與Fevolden等[31]認(rèn)為的脅迫強(qiáng)度和方法可以影響溶菌酶活性變化的觀點(diǎn)一致。

免疫球蛋白M是魚體內(nèi)一種重要的免疫球蛋白[29]，其含量的多少是評(píng)價(jià)魚體免疫應(yīng)答反應(yīng)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[22]。本研究中，子二代中華鱘血清和肝臟免疫球蛋白M含量隨水溫驟降溫差的增大均呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)(P>0.05)，這與低溫脅迫對(duì)銀鯧幼魚[22]、莫桑比克羅非魚(O.mossambicus)[29]的血清免疫球蛋白M影響結(jié)果基本相同，說明溫度的驟降抑制了免疫球蛋白M的產(chǎn)生，降低了魚體的免疫力。

3.3 急性低溫脅迫對(duì)子二代中華鱘消化酶活性的影響

魚類作為變溫動(dòng)物，水溫驟變將直接影響其體內(nèi)消化酶的活性[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度逐漸升高會(huì)增加奧尼羅非魚(O.niloticus×O.aureus)(22～34 ℃)[33]、鼠龍斑(Cromileptesaltivelis♀×Epinepheluslanceolatus♂)幼魚(26～33 ℃)[7]的消化酶活性，但溫度急降會(huì)對(duì)鼠龍斑的消化酶活性產(chǎn)生抑制作用[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著水溫驟降溫差的增大，子二代中華鱘胃、腸和肝臟淀粉酶活性均不斷下降，這與賓石玉等[34]研究結(jié)果相一致，即低溫脅迫會(huì)顯著降低羅非魚體內(nèi)淀粉酶的活性。試驗(yàn)結(jié)果還表明，水溫驟降顯著提高了胃和肝臟的脂肪酶活性，其原因可能為魚體通過提高脂肪酶活性加速體內(nèi)脂肪的降解，從而為魚體在短時(shí)間內(nèi)提供更多能量以應(yīng)對(duì)低溫脅迫帶來的不利影響，這與何杰等[29]的研究結(jié)論基本相符。

施兆鴻等[5]研究認(rèn)為，急性低溫脅迫對(duì)銀鯧幼魚胃蛋白酶活性在48 h內(nèi)無顯著影響，這與本試驗(yàn)結(jié)果不同。本研究中，急性低溫脅迫顯著降低了魚體的胃蛋白酶活性，其原因可能為水溫驟降引起魚體消化系統(tǒng)的代謝強(qiáng)度降低，從而導(dǎo)致消化酶活性和基礎(chǔ)分泌量的降低，在神仙魚(Pterophyllumscalare)[35]和真鯛(Pagrosomusmajor)幼魚[36]的研究中得到類似的結(jié)果。研究結(jié)果還表明，11 ℃組的胃蛋白酶活性顯著高于17 ℃組，其原因可能為，當(dāng)水溫驟降溫差為6 ℃時(shí)，魚體通過消耗糖原、脂肪等物質(zhì)就可以滿足機(jī)體應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能量需求，而當(dāng)驟降溫差增至12 ℃時(shí)，消耗糖原、脂肪等物質(zhì)已經(jīng)不能滿足魚體需求，機(jī)體已經(jīng)開始消耗部分蛋白質(zhì)來加大能量供應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水溫由27 ℃驟降至20 ℃和15 ℃，并脅迫2 h時(shí)，四指馬鲅幼魚的死亡率分別為23.33%和50%[24]。而本研究中，急性低溫脅迫2 h雖未導(dǎo)致子二代中華鱘直接死亡，但對(duì)其抗氧化、免疫和消化酶活性影響顯著。子二代中華鱘在水溫驟降時(shí)，試圖通過提高自身抗氧化能力消除體內(nèi)過多的活性氧自由基，增強(qiáng)免疫能力以避免魚體受感染，并主動(dòng)調(diào)節(jié)脂肪酶、蛋白酶等消化酶的活性為魚體應(yīng)對(duì)脅迫提供必需的能量和物質(zhì)，但過大的驟降溫差顯著抑制了魚體的抗氧化和免疫能力及消化酶活性，對(duì)肝臟組織也可能造成了一定程度的損傷。此外，建議在子二代中華鱘的運(yùn)輸操作過程中，水溫驟降溫差應(yīng)小于6 ℃，以避免其對(duì)魚產(chǎn)生不利影響。