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        MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)組織中的富集與消除

        2019-07-23 00:59:38陳永平韓現(xiàn)芹李春青孫曉旺李寶華付志茹
        水產(chǎn)科學(xué) 2019年4期
        關(guān)鍵詞:花鱸胰臟藥浴

        陳永平,韓現(xiàn)芹,陳 建,李春青,孫曉旺,李 彤,李寶華,付志茹

        ( 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(天津),天津 300221 )

        隨著人們生活水平的提高,對(duì)水產(chǎn)品的消費(fèi)由溫飽向質(zhì)量轉(zhuǎn)變,人們更關(guān)注水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和新鮮度[1-2]。水產(chǎn)品質(zhì)量安全的挑戰(zhàn)主要集中在生產(chǎn)和流通運(yùn)輸環(huán)節(jié)。在鮮活水產(chǎn)品長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程中因密度大、中途晃動(dòng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),降低了經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。為避免損傷和死亡,麻醉劑被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的保活運(yùn)輸中[4-7]。目前漁用麻醉劑已有10余種,其中間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)的麻醉效果最好,對(duì)水產(chǎn)品安全無(wú)害[8],但會(huì)在水產(chǎn)品中殘留,在人體內(nèi)富集,損害人體生理機(jī)能[9-10]。因此使用MS-222后,水產(chǎn)品必須經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的休藥期才能保證安全。為了保證水產(chǎn)品的食用安全性,國(guó)際上對(duì)MS-222在水產(chǎn)品中的使用進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定,以MS-222麻醉的食用魚(yú)必須經(jīng)21 d休藥期才可在市場(chǎng)上銷(xiāo)售[11-12],加拿大規(guī)定的MS-222休藥期為5 d[13-14]。我國(guó)對(duì)麻醉劑在水產(chǎn)品中的使用并沒(méi)有制定相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)或政策法規(guī),這給MS-222等的使用及監(jiān)管帶來(lái)不便。MS-222對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[8]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[15]麻醉效果的研究表明,不同水產(chǎn)動(dòng)物的有效麻醉劑量差別較大[16],但MS-222在草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)、花鱸(Lateolabraxmaculatus)、鯽魚(yú)(Carassiusauratus)、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)體內(nèi)的殘留及消除規(guī)律的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者研究了在水溫(22±2) ℃下,草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)在MS-222藥浴10 h后各組織中的殘留和消除特點(diǎn),以確定合理的用藥方案和休藥期,為藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)的限量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為監(jiān)控MS-222殘留和水產(chǎn)品安全提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        健康草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)取自天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司,平均體質(zhì)量分別為(100±20) g、(110±20) g和(90±20) g,試驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d。試驗(yàn)在1.5 m×1.2 m×1.0 m的養(yǎng)殖水箱中進(jìn)行,注入充分曝氣的自來(lái)水體積200 L。水溫保持在(22±2) ℃,每種魚(yú)各3水箱,每箱60尾。非藥浴期間,每日8:00和18:00投喂,藥浴期間不換水、不投喂。

        MS-222標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%,購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司);甲醇(Merck公司,色譜純),甲酸(Merck公司,色譜純),冰乙酸(國(guó)產(chǎn)分析純),乙酸鈉(國(guó)產(chǎn)分析純);Agela C18固相萃取小柱(6 mL,500 mg,Agela 公司)。

        儀器設(shè)備:AB 5500 Qtrap 三重四極桿質(zhì)譜(AB Sciex 公司);電子天平(Sartorius公司);高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司);高速組織勻漿機(jī)(飛利浦公司,轉(zhuǎn)速10 000 r/min);MS1 Mini-shaker渦輪振蕩器(IKA公司);MiLLi-Q純水器(MiLLipore公司);氮吹儀(Organomation Associates公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI公司);移液器(10、20、100、200、1000 μL,Eppendorf 公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)的富集試驗(yàn)

        參考文獻(xiàn)[13,17],試驗(yàn)水箱注入充分曝氣的自來(lái)水200 L,MS-222質(zhì)量濃度為50 mg/L,水溫保持在(22±2) ℃,分別于藥浴0.5、1、2、3、7 h和10 h時(shí),隨機(jī)取出草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)各3尾。采樣時(shí),用清潔淡水將魚(yú)表面的MS-222藥液沖洗干凈。取2 mL一次性注射器,自胸鰭基部插入心臟取血,放入含有0.3 mL 1%肝素鈉的離心管中,混合均勻后離心,取上層血漿,置于-18 ℃保存。取出肝(胰)臟和魚(yú)肉,分別進(jìn)行均質(zhì)處理,置于-18 ℃保存。

        1.2.2 MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)的消除試驗(yàn)

        試驗(yàn)進(jìn)行10 h后,將草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)轉(zhuǎn)入清潔淡水中進(jìn)行消除試驗(yàn),每種魚(yú)3個(gè)網(wǎng)箱,每個(gè)網(wǎng)箱60尾,試驗(yàn)過(guò)程保持充氣,溶解氧>5 mg/L。在0.5、1、2、4、6、8、16、32、96、120、192、264、336、432、528、624、720 h時(shí),每個(gè)水箱隨機(jī)選取 3 尾,用清潔淡水將魚(yú)體表面的 MS-222藥液沖洗干凈。按1.2.1方法采集血液、肌肉、肝(胰)臟樣品,置于-18 ℃保存。

        1.3 MS-222測(cè)定方法

        采集樣品處理:取均質(zhì)好的肌肉、肝(胰)臟各2 g,血液2 mL于50 mL離心管中,各加入10 mL 0.2 mol/mL的乙酸—乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)和50%甲醇溶液,均質(zhì)。用5 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液和5 mL 50%甲醇溶液清洗刀頭,合并提取液,8000 r/min離心10 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL梨形瓶中,于40 ℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。離心管中剩余殘?jiān)屑尤?5 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液,渦旋1 min,8000 r/min離心5 min,重復(fù)1次。將上清液與旋蒸后的溶液合并。將待凈化液轉(zhuǎn)移至依次用3 mL甲醇與3 mL乙酸—乙酸鈉緩沖液活化的固相萃取柱中,用2 mL 7.5%的甲醇溶液淋洗,抽至近干后用2 mL甲醇和1%乙酸溶液的混合液(體積比1∶1)進(jìn)行洗脫。洗脫液收集于10 mL離心管中,過(guò)0.2 μm微孔濾膜后,待測(cè)。

        MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:稱(chēng)取10.0 mg的MS-222標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用甲醇逐級(jí)稀釋至2、10、50、100、200、500、1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。配制的MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。以目標(biāo)物選擇離子色譜峰面積為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

        MS-222測(cè)定回收率和檢出限:取空白樣品添加一定量的MS-222標(biāo)準(zhǔn)溶液,充分混勻,靜置30 min,每組3個(gè)平行,再按照樣品處理方法處理后進(jìn)樣,根據(jù)測(cè)定值計(jì)算組織中MS-222的含量??瞻讟悠诽砑恿糠謩e為2、10、100 μg/kg,以MS-222的3倍信噪比(S/N)作為方法檢出限。

        色譜—質(zhì)譜條件:色譜柱Shim-pack XR-ODS (2.2 μm,75 mm×2.1 mm);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相: A-0.1%甲酸,B-乙腈(55∶45,V∶V等梯度洗脫);流速:0.25 mL/min。電噴霧電離源正離子模式,噴霧電壓4500 V,GS1:60,GS2:40,DP:65,EP:10,CXP:10,掃描模式選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)。選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量(表1)。

        表1 目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件

        注:*為定量碎片離子.

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        用Microsoft Excel 2010計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線、消除方程及休藥期和繪制。消除方程為:

        C=C0e-kt

        式中,C表示藥物含量,C0為殘留消除對(duì)數(shù)曲線的截距(μg/kg或ng/mL),k表示消除速率常數(shù),t代表消除時(shí)間(h)。

        2 結(jié) 果

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)、方法檢測(cè)限及回收率

        在1~1000 ng/mL內(nèi)MS-222質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好,其線性方程分別為y=1.28×104x-2.84×104,r=0.9999。在本試驗(yàn)條件下,組織中MS-222檢出限為1.0 μg/kg,MS-222檢出限色譜見(jiàn)圖1,定量限為2.0 μg/kg。各組織中低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度加標(biāo)水平的MS-222平均回收率為71.4%~91.2%,表明分析方法滿足要求。

        2.2 MS-222在3種魚(yú)組織中的富集

        藥浴0~3 h時(shí),草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)血液、肌肉中MS-222殘留量呈上升趨勢(shì),0~1 h時(shí),上升快速,1~3 h,上升平緩,此階段MS-222的吸收速率略大于代謝速率,但吸收和代謝趨于平衡,藥浴3 h時(shí)MS-222含量達(dá)到峰值,藥浴3 h后,呈輕微下降趨勢(shì);0~7 h,3種魚(yú)肝(胰)臟中MS-222殘留量總體呈上升趨勢(shì),0~2 h,上升趨勢(shì)快速,2~7 h,上升趨緩,麻醉劑的吸收和代謝趨于平衡,藥浴7 h時(shí)MS-222含量達(dá)到峰值,藥浴7 h后,肝(胰)臟中MS-222殘留量輕微下降;3種魚(yú)組織中MS-222的殘留量為C血液>C肝(胰)臟>C肌肉;肝(胰)臟中MS-222殘留量達(dá)到峰值的時(shí)間均比血液和肌肉中延遲了1 h,3種魚(yú)組織中MS-222富集殘留量為C鯽魚(yú)血液>C草魚(yú)血液>C花鱸血液,C草魚(yú)肌肉>C花鱸肌肉>C鯽魚(yú)肌肉,C鯽魚(yú)肝胰臟>C花鱸肝臟>C草魚(yú)肝胰臟(表2)。

        圖1 魚(yú)樣檢出限加標(biāo)色譜圖

        表2 水溫(22±2) ℃時(shí)草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)MS-222富集殘留量

        2.3 MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)組織中的消除

        在0~720 h內(nèi),隨時(shí)間的遞增,3種魚(yú)各組織中MS-222殘留量逐漸降低,在0~8 h內(nèi)MS-222殘留量降低速率尤為明顯,在8~528 h內(nèi)降低速率趨于平緩,624 h后在3種魚(yú)血液、肌肉組織中未檢出MS-222殘留,草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)肝(胰)臟組織中殘留量分別為3.6、4.8、4.5 μg/kg,在代謝720 h后,3種魚(yú)各組織中均未檢出MS-222(表3)。血液和肌肉組織中MS-222代謝速率無(wú)明顯差異,肝(胰)臟代謝速率較前兩種組織慢;花鱸富集MS-222殘留較草魚(yú)、鯽魚(yú)小,草魚(yú)、鯽魚(yú)組織富集MS-222殘留無(wú)明顯差異,MS-222殘留在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)中的消除速率無(wú)明顯差異,所有組織中MS-222殘留可以在30 d后代謝完全(表4~表6),建議在水溫為(22±2) ℃時(shí),MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)的休藥期應(yīng)為30 d以上。

        表3 水溫(22±2) ℃時(shí)草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)的MS-222消除殘留量

        表4 MS-222在草魚(yú)組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

        注:AUC(0~t),0~t時(shí)間內(nèi)血藥含量—曲線下面積;AUC(0~∞),0~∞時(shí)間內(nèi)血藥含量—曲線下面積;MRT(0~t),0~t時(shí)間內(nèi)血藥平均滯留時(shí)間;MRT(0~∞),0~∞時(shí)間內(nèi)血藥平均滯留時(shí)間.

        表5 MS-222在花鱸組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

        表6 MS-222在鯽魚(yú)組織中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

        3 討 論

        3.1 MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)不同組織中的富集

        藥浴會(huì)使MS-222富集到草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)的不同組織中,血液中MS-222的殘留量較肝(胰)臟和肌肉高,肝(胰)臟中的殘留量高于肌肉。有研究表明,水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)腦組織和血液中MS-222的富集程度低于肌肉和肝臟,且消除速度更快[18]。但是,MS-222在魚(yú)體的富集和消除規(guī)律也可能與魚(yú)體的環(huán)境條件、種類(lèi)以及藥物含量等因素有關(guān)。這與MS-222在大菱鲆體內(nèi)的富集消除規(guī)律基本一致[5]。血液、肌肉、肝臟中的MS-222富集殘留量分別在藥浴3、3、7 h后達(dá)到峰值,隨后草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)的血液、肌肉、肝(胰)臟的殘留量分別比峰值下降了4.5%、6.7%、0.9%,6.3%、7.6%、2.6%,4.9%、6.7%、0.9%。10 h內(nèi)血液、肌肉、肝(胰)臟的富集殘留草魚(yú)和鯽魚(yú)較為接近,分別為2236、2266 ng/mL(血液),1189、1158 μg/kg(肌肉),2150、2094 μg/kg(肝胰臟),草魚(yú)和鯽魚(yú)組織中MS-222富集殘留量均大于花鱸(1739 ng/mL、1282 μg/kg、1812 μg/kg)。

        3.2 MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)不同組織中殘留量的消除規(guī)律

        消除半衰期和藥物平均滯留時(shí)間是體現(xiàn)藥物在動(dòng)物體內(nèi)消除特征的兩個(gè)重要參數(shù)(表4)。MS-222在草魚(yú)血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為5.4、6.7、7.9 h;在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中的消除半衰期分別為3.9、5.1、5.7 h;在鯽魚(yú)血漿、肌肉、肝胰臟組織中的消除半衰期分別為4.8、6.3、8.4 h。MS-222在草魚(yú)血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時(shí)間分別為93.5、96.2、110.6 h;在花鱸血漿、肌肉、肝臟組織中平均滯留時(shí)間分別為96.8、96.2、103.1 h;在鯽魚(yú)血漿、肌肉、肝胰臟組織中平均滯留時(shí)間分別為104.7、112.8、110.5 h。MS-222在各組織中的消除速率為V肝(胰)臟

        3.3 MS-222休藥期的確定

        MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)組織中的富集和消除代謝規(guī)律為制定MS-222在水產(chǎn)品中的休藥期提供了科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在水溫(22±2) ℃下,草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)組織中的MS-222殘留消除至檢出限以下需要30 d以上,因此,建議在(22±2) ℃時(shí),MS-222在草魚(yú)、花鱸、鯽魚(yú)體內(nèi)的休藥期應(yīng)為30 d以上。

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