王 蕊，付維來，陳 思，陳 晶，易敢峰

( 1.福建大北農水產科技有限公司，福建 漳州 363500；2.北京大北農科技集團股份有限公司，飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100080 )

2016年全國羅非魚(Oreochromis)養(yǎng)殖量為1.866×106t，比2015年提高了4.88%，穩(wěn)居世界首位。羅非魚生長快、產量高、抗病力強，是淡水養(yǎng)殖優(yōu)秀品種。但是近年來，全球性羅非魚鏈球菌病的暴發(fā)給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失[1-2]?？股豙3]一直是防控該病的首選，但是抗生素的殘留及病原菌耐藥性等問題突顯，威脅養(yǎng)殖環(huán)境和人類的健康。

益生菌以安全、有效的特性受到廣泛的研究與應用。據已有研究報道，對羅非魚鏈球菌有抑制作用的菌株涉及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、凝結芽孢桿菌(B.coagulans)、諾卡氏菌(Nocardiasp.)及植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)等[4-8]。諸多研究表明，芽孢桿菌具有拮抗致病菌、凈化池塘水質、提高水產動物生長性能的效果[9-11]。因此，芽孢桿菌以其適應性強、耐加工、生長快、分布廣，且具有較多的生物學特性，如分泌多種生物酶、降解亞硝酸鹽和氨態(tài)氮、產生抑制有害菌生長的代謝產物等，被廣泛用于飼料添加劑及水質改良中。

筆者在點種法和牛津杯法的基礎上進行拮抗株篩選方法的改進，從吉富羅非魚(O.niloticusGIFT)腸道中分離篩選出一株安全、顯著抑制無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的土著芽孢桿菌，進行亞硝酸鹽降解能力、產酶能力、藥敏性等生物學特性檢測以及最佳抑菌活性與發(fā)酵時間的關系研究，旨在為當地羅非魚鏈球菌病防治提供良好的菌種資源及該菌株的發(fā)酵生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

指示菌為本實驗室分離的無乳鏈球菌S-2，來自福建鏈球菌發(fā)病癥狀典型的瀕死羅非魚魚體。待分離樣品來自福建漳州，主要針對第1年羅非魚鏈球菌病高發(fā)，第2年仍然養(yǎng)殖羅非魚品種的養(yǎng)殖池塘。共采集6口池塘的底泥、水樣及健康羅非魚腸道樣品共計18份，采集地點為漳州市區(qū)、漳浦縣、云霄縣、長泰縣、南靖縣。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、新鮮一次性兔血瓊脂平板、蛋白酶檢測培養(yǎng)基、纖維素酶檢測培養(yǎng)基、淀粉酶檢測培養(yǎng)基[12]、發(fā)酵培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米面5 g/L，蛋白胨10 g/L，蔗糖4 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水合硫酸亞鐵0.25 g/L，七水合硫酸鎂0.5 g/L，一水合硫酸錳0.25 g/L，碳酸鈣1 g/L，消泡劑0.5 mL/L；pH 7.0～7.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

(1)底泥樣：取約1 g池塘泥樣溶解在10 mL無菌水中振蕩均勻，85 ℃水浴加熱15 min。

(2)水樣：取20 mL池塘水樣，85 ℃水浴加熱15 min。

(3)羅非魚腸道樣品：用鑷子將生理鹽水中的羅非魚腸道取出至10 mL無菌水中充分研磨，85 ℃水浴加熱15 min。

各樣品均梯度稀釋后涂平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。將平板生長的菌株分離純化作為供試菌株。

1.2.2 溶血性檢測

溶血試驗是檢測供試菌株是否對動物紅細胞產生溶解反應，是益生菌安全性評價的一部分。將供試菌株接種到新鮮的兔血瓊脂平板上，放于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，篩選無溶血性的菌株進行下一步檢測。

1.2.3 拮抗株的篩選

(1)指示菌涂布平板法：無乳鏈球菌接種于LB液體培養(yǎng)基中。37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，取100 μL無乳鏈球菌菌液按10-2稀釋度稀釋并涂板，將供試菌株點于平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。觀察抑菌圈，初步篩選出有抑菌效果的菌株。

(2)指示菌倒平板法：將無乳鏈球菌及初步篩選的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。為了找到無乳鏈球菌菌液最適接種密度及培養(yǎng)基最適澆注量，設置接種密度為106、107cfu/mL和108cfu/mL，接種量均為50 μL，分別加入到還未凝固的LB固體培養(yǎng)基中(20、25 mL和30 mL)，搖勻，傾倒至已放有牛津杯的平板中，待培養(yǎng)基凝固取出牛津杯。向孔中加入過濾除菌的發(fā)酵上清液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h觀察抑菌圈大小。

(3)拮抗株抑菌物質的抑菌活性對溫度的耐受性：取發(fā)酵液10 mL，過濾除菌保留上清液，分別于60、80、100、120 ℃處理30 min，自然冷卻后指示菌倒平板法測抑菌活性。以37 ℃培養(yǎng)不做任何處理的發(fā)酵上清液做對照。

1.2.4 菌種鑒定

1.2.4.1 菌體形態(tài)觀察

革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化鑒定

方法參照伯杰氏細菌鑒定手冊[13]進行。

1.2.4.3 16S rRNA 基因測序

利用細菌通用引物27F/1492R進行靶基因的擴增，16S rRNA基因PCR引物：正向引物27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，對應于大腸桿菌(Escherichiacoli)第8～27堿基位置；反向引物P6，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，對應于大腸桿菌第1492～1510堿基位置。目的條帶為1.5 kb，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并測序，在美國國立生物技術信息中心數據庫對序列進行比對，得到未知菌與基因庫中已知菌的相似度，用鄰接法進化樹分析該菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.5 最佳抑菌活性與發(fā)酵時間關系的測定

將待測菌株進行30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，每隔4 h取發(fā)酵液鏡檢芽孢產生情況并檢測抑菌活性，分析發(fā)酵時間與抑菌活性的關系。

1.2.5.1 種子液制備

一級種子液：挑取菌株單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

二級種子液：吸取1 mL一級種子液于100 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

將上述制備的二級種子液以1%的接入量接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度37 ℃，轉速70～100 r/min，灌壓0.5 Mpa，通風比1∶0.6～1∶0.4，pH5.5～7.5，發(fā)酵時間16～20 h。

1.2.6 生物酶檢測

將待測菌點種于蛋白酶檢測平板上，以透明圈大小顯示該菌株產蛋白酶活力。

將待測菌點種于纖維素酶檢測平板上，培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基中倒入剛果紅溶液(1 mg/mL)染色10～15 min，倒掉剛果紅溶液，加入1 mol/L的NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液。根據透明圈大小判斷纖維素酶活力。

將待測菌點種于淀粉酶檢測平板上，培養(yǎng)24 h后固體碘熏蒸著色。具體方法：取1 g固體碘均勻平鋪在白紙上，將培養(yǎng)好的平皿倒置在固體碘上熏蒸30 s，并均勻轉動。淀粉遇碘變?yōu)樗{色，根據透明圈大小判斷淀粉酶活力大小。

1.2.7 亞硝酸鹽降解試驗

1.2.7.1 亞硝酸鹽標準曲線

配制不同質量濃度的亞硝酸鹽溶液(0～4 mg/L)，置于酶標儀下測量550 nm處吸光值(OD550)，作亞硝酸鹽質量濃度與OD550的對應性標準曲線。

1.2.7.2 亞硝酸鹽檢測培養(yǎng)基

蒸餾水50 mL，魚料0.05 g，2.5 mg/L的亞硝酸鈉溶液50 μL。121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。試驗組接種50 μL菌液(終密度為105cfu/mL)，對照組加50 μL生理鹽水，每組3個平行置于37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)，格里斯試劑法測定OD550，用標準曲線計算對應亞硝酸鹽質量濃度。

1.2.8 藥敏試驗及安全性試驗

1.2.8.1 藥敏試驗

采用紙片擴散法對待測菌株進行藥物敏感性測定。待測菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，菌液密度約108cfu/mL，取10-2稀釋度100 μL菌液涂布平板，取藥敏片均勻放于平板中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察抑菌圈。

1.2.8.2 安全性檢測

參考文獻[14]，采用背部肌肉注射法進行菌種安全性檢測。設對照組和試驗組，每組3個平行。每個平行組10尾羅非魚，平均質量為(8.3±1.4) g。試驗組每尾羅非魚分別注射1×109、1×108、1×107cfu/mL的菌液200 μL，對照組注射同等量的生理鹽水，正常飼喂7 d，觀察羅非魚的死亡情況。

1.2.9 菌株LT3-1對無乳鏈球菌的影響

試驗用魚為吉富羅非魚，采用循環(huán)水養(yǎng)殖，規(guī)格一致的羅非魚120尾，分成對照組和試驗組，每組3個平行，每組平行20尾，初始體質量(46.91±0.17) g。對照組只飼喂飼料，試驗組飼喂添加菌株LT3-1的飼料，菌粉活菌含量1010cfu/g，添加量0.05%。養(yǎng)殖4周后采取攻毒試驗，腹腔注射密度為1×108cfu/mL的無乳鏈球菌S-2菌液0.2 mL，每日觀察并統(tǒng)計試驗魚的發(fā)病情況，記錄攻毒后14 d內的死亡率。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果

經過分離純化18份樣品，初步得到77株芽孢菌。池水、底泥及健康羅非魚腸道中各得到20、29、28株芽孢菌(表1)。

表1 樣品的菌株分離數量

2.2 溶血性檢測

經過血瓊脂板培養(yǎng)，共篩選到30株無溶血性芽孢菌，并用于抑菌能力檢測。

2.3 拮抗菌株篩選

試驗發(fā)現，指示菌的接種密度以及平板培養(yǎng)基的薄厚影響抑菌圈的大小。因此本試驗進行了指示菌的接種密度及平板培養(yǎng)基澆注量(20、25、30 mL)的探索。最終確定25 mL培養(yǎng)基與1×107cfu/mL指示菌50 μL混勻制板，得到的抑菌圈最清晰。經篩選，5株芽孢菌具有抑制無乳鏈球菌的能力，其中菌株LT3-1抑菌效果最強且穩(wěn)定，抑菌圈平均直徑可達(25.30±0.57) mm(圖1)，因此，對菌株LT3-1進行進一步研究。試驗發(fā)現，菌株LT3-1抑菌物質活性隨著溫度的升高(60、80、100、120 ℃)逐漸減弱，與不做任何處理的發(fā)酵上清液對照比較，抑菌圈直徑自26.65 mm降至10.10 mm，但依然存在抑菌活性(圖2)。說明菌株LT3-1抑菌物質在一定程度上可以耐受較高的溫度，此特點使該菌在發(fā)酵液后處理工藝上具有明顯優(yōu)勢。

圖1 菌株LT3-1發(fā)酵上清液抑菌活性使用SCAN 1200，6.1.3.0版分析的樣品.

圖2 溫度對菌株LT3-1抑菌物質活性的影響

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察

菌株LT3-1在37 ℃，LB平板上生長為扁平、邊緣不整齊的白色菌落。革蘭氏染色陽性，長桿狀(圖3a)。芽孢形態(tài)見圖3b，菌體膨大，中間呈現空心狀。

2.4.2 生理生化測定及16S rRNA基因序列鑒定

菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10T[13]的生理生化指標測定結果見表2。由表2可見，菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式菌株DSM10T的測定結果相同。

菌株LT3-1 16S rRNA基因測序后，得到的序列長度為1420 bp，比對結果表明，該菌與枯草芽孢桿菌BGSC 3A28最近，相似性為99%。采用Mega 4.0軟件鄰接法構建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，菌株LT3-1與枯草芽孢桿菌模式種DSM10T聚在同一分支，結合生理生化結果，菌株LT3-1鑒定為枯草芽孢桿菌，16S rRNA基因GenBank序列號為MG719524。

表2 菌株LT3-1生理生化特征

圖3 菌株LT3-1鏡下形態(tài)示意a.普通狀態(tài)下的菌體； b.產生芽孢的菌體.

圖4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5 最佳抑菌活性與發(fā)酵時間的關系

枯草芽孢桿菌LT3-1隨著發(fā)酵時間的增加抑菌活性增加，發(fā)酵4 h后，上清液出現較弱抑菌活性(圖5)。16～20 h時抑菌活性較強，雖有上升，但是上升程度較小，基本保持穩(wěn)定。經顯微鏡觀察，枯草芽孢桿菌LT3-1發(fā)酵16 h出孢完全，因此，出孢率與抑菌活性存在一定的正相關性。

2.6 生物酶檢測

試驗表明，枯草芽孢桿菌LT3-1可以水解酪蛋白，形成直徑為9 mm的透明圈(圖6a)，說明該菌具有分泌蛋白酶的能力；淀粉平板遇碘顯藍色，而菌落周圍出現直徑9 mm透明圈(圖6b)，說明該菌具有分泌淀粉酶的能力；纖維素酶平板經剛果紅染色，菌落周圍形成直徑12 mm的透明圈(圖6c)，說明該菌具有水解羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的能力，可以分泌纖維素酶。

圖5 枯草芽孢桿菌LT3-1抑菌活性及出孢率隨發(fā)酵時間的變化

圖6 枯草芽孢桿菌LT3-1水解酪蛋白(a)、淀粉(b)及羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(c)結果

2.7 亞硝酸鹽降解試驗

經檢測，密度為105 cfu/mL的枯草芽孢桿菌LT3-1可以顯著降低亞硝酸鹽水平，6 h即可將亞硝酸鹽質量濃度由2.5 mg/L降至0.03 mg/L(圖7)，亞硝酸鹽降解率可以達98.8%，凈水效果顯著(P<0.05)。

2.8 藥敏試驗及安全性試驗

2.8.1 藥敏試驗

試驗檢測了枯草芽孢桿菌LT3-1對7個類型9種抗生素的敏感性。檢測結果表明，枯草芽孢桿菌LT3-1對所檢測的9種抗生素紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、四環(huán)素、氧氟沙星、萬古霉素、氯霉素、利福平均表現為敏感(表3)。

圖7 枯草芽孢桿菌LT3-1對亞硝酸鹽的降解效果

表3 枯草芽孢桿菌LT3-1藥物敏感試驗結果

2.8.2 安全性試驗

經過1周的安全性試驗，結果表明，肌肉注射密度為1×107cfu/mL的枯草芽孢桿菌LT3-1菌液后，羅非魚可以正常存活，無異?，F象。

2.9 枯草芽孢桿菌LT3-1對無乳鏈球菌感染的影響

攻毒試驗第6 d后出現死亡情況，死亡高峰期出現在攻毒后的第7～9 d(圖8)。對照組的成活率為(73.33±6.67)%，顯著低于試驗組(93.33±3.33)%，(P<0.05)。表明枯草芽孢桿菌LT3-1對無乳鏈球菌感染吉富羅非魚的拮抗效果顯著。

圖8 攻毒14 d內試驗魚的存活率

3討 論

羅非魚鏈球菌病病原主要為海豚鏈球菌(S.iniae)和無乳鏈球菌，2009年后主要流行病原為無乳鏈球菌，有新的株型和克隆系出現[15-17]，但并未發(fā)現有菌種變化。因此本研究以羅非魚無乳鏈球菌為指示菌株進行拮抗菌的篩選。

劉觀斌等[9]篩選出1株拮抗菌——蠟樣芽孢桿菌NY5，對無乳鏈球菌的抑制圈直徑達26.67 mm，對50 mg/L的亞硝酸鹽氮12 h去除效率達到100%。李仕成[5]篩選到1株解淀粉芽孢桿菌J4，對無乳鏈球菌的抑制圈直徑達16 mm，并且發(fā)現，飼料中添加107cfu/g和108cfu/g的解淀粉芽孢桿菌J4，可顯著降低餌料系數，提高羅非魚的質量增加率、生長性能、非特異性免疫力及抗氧化能力。由此可見，芽孢桿菌可同時具備拮抗無乳鏈球菌和凈水、促生長、提高免疫力的功能。本研究通過體內和體外兩種方式對篩選到的枯草芽孢桿菌LT3-1的拮抗無乳鏈球菌效果進行了分析，體外抑菌圈直徑達(25.30±0.57) mm；體內動物試驗表明，添加枯草芽孢桿菌LT3-1的試驗組羅非魚攻毒后存活率達93.33%，顯著高于對照組(73.33%)(P<0.05)。枯草芽孢桿菌LT3-1具備快速降解水體亞硝酸鹽的能力，2.5 mg/L的亞硝酸鹽氮6 h降解率達98.8%，高于枯草芽孢桿菌HAINUP40[18]的降亞硝酸鹽能力(12 h亞硝酸鹽去除率94.12%)。枯草芽孢桿菌LT3-1對水產動物的生長性能、免疫力及抗氧化能力方面的研究還有待開展。

益生菌對病原菌的拮抗作用方式并不相同。乳酸菌可通過分泌有機酸降低周圍環(huán)境pH或分泌過氧化氫、雙乙酰、細菌素等代謝產物達到抑制病原菌的效果[19-20]。有些芽孢桿菌也可以通過分泌有機酸抑制病原菌如凝結芽孢桿菌。但是大多數芽孢桿菌一般通過分泌脂肽類、聚酮類、蛋白類抑菌物質發(fā)揮對病原菌的抑菌作用。連燕萍[21]研究表明，解淀粉芽孢桿菌MG-3的抑菌物質L-1為脂肽類抗生素IturinA。分離自海參腸道的枯草芽孢桿菌HS-A38分泌的抑菌物質為直鏈抗菌脂肽，主要組分為桿菌霉素Bacillomycin D[22-24]。陳輝[7]發(fā)現1株諾卡氏菌可以顯著抑制海豚鏈球菌的生長，其抑菌物質耐高溫，對蛋白酶敏感，具有酸堿穩(wěn)定性，硫酸銨沉淀試驗證明為蛋白質類物質。本研究中篩選得到的枯草芽孢桿菌LT3-1的抑菌物質可以耐受較高溫度。其過濾除菌后的發(fā)酵上清液具有顯著的抑菌活性，說明枯草芽孢桿菌LT3-1對無乳鏈球菌的抑制作用并不是通過營養(yǎng)競爭而是通過分泌抑菌物質實現的，其抑菌物質的主要組分需進一步研究。其次，該菌發(fā)酵0～4 h時，發(fā)酵上清液抑菌活性雖然有提高但是處于較弱的水平，發(fā)酵4～16 h為對數期，其上清液抑菌活性明顯增強，在發(fā)酵16 h時芽孢產生完全，達到穩(wěn)定期，其抑菌活性也達到最大，推測該菌的抑菌物質可能為次級代謝產物，可進行發(fā)酵生產獲取代謝產物，建議發(fā)酵終點為16 h。

溶血是致病菌的致病機理之一，與動物安全性共同被認為是益生菌安全性評價的重要方面[25-27]。諸多學者把溶血性、常見抗生素敏感性及對宿主的安全性納為安全性評估指標中。王曉琳等[28]研究表明，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)VZ5株均未表現出溶血特征，且對多數常見抗生素敏感或中度敏感。在106cfu/mL菌液密度下，兩株菌未對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)表現出明顯的毒害作用。本研究篩選到的枯草芽孢桿菌LT3-1亦無溶血現象，對檢測的9種抗生素均敏感，在107cfu/mL菌液注射密度下對羅非魚安全。因此，該菌株可以應用在水產養(yǎng)殖中。

4 結 論

綜上所述，篩選自吉富羅非魚腸道的枯草芽孢桿菌LT3-1對無乳鏈球菌的抑菌圈直徑達(25.30±0.57) mm，攻毒后，飼喂含枯草芽孢桿菌LT3-1飼料的羅非魚存活率顯著高于對照組(P<0.05)。該菌發(fā)酵16 h抑菌活性最強，其抑菌物質可以耐受較高溫度?？莶菅挎邨U菌LT3-1具有分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的能力，可以在提高餌料利用率、維護腸道消化健康方面發(fā)揮作用；該菌具有快速降低水體亞硝酸鹽水平的能力；該菌分離自健康羅非魚腸道，無溶血，對羅非魚安全可靠，可以作為當地羅非魚無乳鏈球菌防控及凈化水質方面的良好材料。