王曉，蘇娟，李昆華，韓鄲，張萬(wàn)巧，岳健*

(1.云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 6502228； 2.云南青谷生物科技有限公司，云南 昆明 650225)

川貝母(FritillariacirrhosaD. Don)為百合科貝母屬多年生草本植物，《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版一部)收載的藥材川貝的基源品種之一，主要分布于西藏、云南、四川和青海等海拔1 800～4 200 m的高寒區(qū)域[1-2]。川貝母具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳、散結(jié)消痛的功效[3]，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞嗽、痰中帶血等，具有止咳圣藥之稱[4]，中藥處方用量巨大，加上生境特殊且種子休眠期長(zhǎng)、自然萌發(fā)率低、野生資源過(guò)度采挖等原因[3]，川貝母資源不斷減少，已被列入國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物名單[2]，并且來(lái)源物種已被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》收錄[4]。

相較于傳統(tǒng)的繁殖方法，利用組織培養(yǎng)繁殖川貝母能節(jié)省育苗用地、提高繁殖系數(shù)、縮短育苗周期、維持母種的優(yōu)良性狀[5]，對(duì)挽救川貝母處境和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。目前，對(duì)川貝母的組織培養(yǎng)已有報(bào)道[5-7]，但是鮮見(jiàn)關(guān)于褐化現(xiàn)象的研究報(bào)道[8]。外植體菌類污染、玻璃化、褐化現(xiàn)象已經(jīng)成為制約藥用植物組織培養(yǎng)發(fā)展的重要因素，并稱為藥用植物組織培養(yǎng)三大瓶頸，其中，褐化問(wèn)題涉及方面復(fù)雜[9-10]。本研究以川貝母鱗莖為外植體，通過(guò)比較消毒方式、培養(yǎng)條件、褐化抑制劑對(duì)川貝母組培褐化影響程度，為川貝母組織培養(yǎng)中控制褐化現(xiàn)象和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)川貝母組培苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

川貝母外植體來(lái)源于云南山里紅生物科技有限公司瀘西分公司種植基地，于9月至10月取當(dāng)年生鱗莖。

1.2 方法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備

采集新鮮野生川貝母鱗莖，用流水沖洗60 min，用洗潔精晃搖清洗5 min，在超凈臺(tái)上消毒處理，無(wú)菌水充分清洗，無(wú)菌濾紙吸干水分，切成 0.5 cm×0.5 cm的塊狀[11-13]，接種至培養(yǎng)基，每瓶接種1個(gè)鱗莖塊，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有激素6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為5.8；光照強(qiáng)度為1 500～2 500 lx，光照周期12 h·d-1，培養(yǎng)溫度(25±2)℃；光照培養(yǎng)箱為上海一恒MGC-100；培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)外植體褐化率和組培苗獲得率。

1.3 處理設(shè)計(jì)

1.3.1 消毒方式

設(shè)置3個(gè)處理：1，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；2，75%乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理10 min；3，0.1% HgCl2處理5 min，再用2%次氯酸鈉處理5 min。

1.3.2 消毒時(shí)間

設(shè)置6個(gè)處理：1，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理5 min；2，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理6 min；3，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理7 min；4，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理8 min；5，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理9 min；6，75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min。

1.3.3 培養(yǎng)條件

在超凈臺(tái)上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；消毒后接種培養(yǎng)基，設(shè)置3個(gè)處理：1，光照周期8 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、溫度(15±2)℃；2，光照周期12 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期12 h·d-1、溫度為15±2 ℃；3，光照周期16 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期8 h·d-1、溫度(15±2)℃。

1.3.4 不同抑制劑處理

在超凈臺(tái)上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理10 min；消毒后接種，設(shè)置5個(gè)處理：在培養(yǎng)基中分別添加2 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、200 mg·L-1抗壞血酸(VC)、2 mg·L-1檸檬酸(CA)、300 mg·L-1硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2 g·L-1活性炭(AC)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

褐化率(%)=褐化株數(shù)/接種總數(shù)×100；獲得率(%)=有效株數(shù)(未污染未褐化)/接種總數(shù)×100。數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式處理的效果

以清洗后不做任何消毒處理的川貝母鱗莖接種培養(yǎng)作為空白對(duì)照，由表1可知，在相同消毒時(shí)間和培養(yǎng)條件下，處理組川貝母鱗莖外植體的褐化程度均大于空白對(duì)照組，在所有處理中，采用75%乙醇處理30 s，再用2%次氯酸鈉處理10 min的消毒方式對(duì)川貝母鱗莖組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化情況控制較好，褐化率最低，但組培苗獲得率也較低；采用0.1% HgCl2處理5 min，再用2%次氯酸鈉處理5 min獲得率最高，可見(jiàn)HgCl2的滅菌消毒作用強(qiáng)于次氯酸鈉和乙醇，而導(dǎo)致褐化的嚴(yán)重程度則為HgCl2>乙醇>次氯酸鈉。

表1 不同消毒方式處理對(duì)川貝母組培褐化和獲得率的影響

注：同列無(wú)相同小寫字母表示組間差異顯著。表2～4同。

2.2 不同消毒時(shí)間處理的效果

將川貝母鱗莖進(jìn)行清洗后，在超凈臺(tái)上用75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2處理不同時(shí)間，統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率和組培苗獲得率，通過(guò)目視法對(duì)褐化程度進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表2。隨著HgCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其褐化率和褐化程度呈遞增趨勢(shì)；用0.1% HgCl2處理9、10 min時(shí)組培苗獲得率在最大，但與處理8 min時(shí)的獲得率無(wú)顯著差異。培養(yǎng)至第20天時(shí)，所有處理均出現(xiàn)有褐化現(xiàn)象，到第30天褐化程度均有加深，0.1% HgCl2處理8 min及以內(nèi)褐化程度較輕。

表2 不同消毒時(shí)間對(duì)組培褐化率、獲得率和褐化程度的影響

注：—，未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；+，輕度褐化；++，中度褐化；+++，嚴(yán)重褐化。

2.3 不同培養(yǎng)條件處理的效果

以接種后于光照周期12 h·d-1，暗周期12 h·d-1，溫度均為(25±2)℃條件下培養(yǎng)作為空白對(duì)照組，與空白對(duì)照組相比，變溫處理試驗(yàn)組的外植體褐化率均顯著降低，獲得率均顯著提高，光照時(shí)間越長(zhǎng)，褐化率越低，獲得率越高(表3)。川貝母為高寒山區(qū)生長(zhǎng)植物，在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)較為適宜，同時(shí)，低溫環(huán)境較好地抑制了川貝母中多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶等與褐化相關(guān)的酶活性。

2.4 不同抑制劑處理的效果

由表4可知，培養(yǎng)基中添加不同抑制劑對(duì)組培褐化現(xiàn)象均有較好的抑制效果，獲得率也均有提高。培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)時(shí)，褐化率最低，獲得率最高；添加抗壞血酸(VC)、檸檬酸(CA)和活性炭(AC)的試驗(yàn)組褐化率與獲得率無(wú)顯著差異。由于VC和CA對(duì)植物生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，而AC在吸附褐化物質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附植物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，添加AC的試驗(yàn)組中出現(xiàn)了種苗壞死現(xiàn)象。

表3 不同培養(yǎng)條件對(duì)組培褐化和獲得率的影響

表4 不同抑制劑處理對(duì)組培褐化和獲得率的影響

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生有很多因素決定，包括外植體的生理狀態(tài)和部位、取材的時(shí)間和大小、預(yù)處理的方式、培養(yǎng)的條件和因素、褐化抑制劑的種類，以及繼代轉(zhuǎn)瓶的頻率等，通常通過(guò)相應(yīng)的手段來(lái)控制植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化率[14-18]。本研究以誘導(dǎo)率最高的鱗莖作為外植體[17]，研究不同因素對(duì)川貝母組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象的影響，結(jié)果表明，試驗(yàn)所用滅菌消毒試劑均能加重受傷外植體的褐化程度，同時(shí)，隨著消毒滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率和褐化程度均有明顯的增強(qiáng)，這與庾韋花等[15]的結(jié)論一致：隨著消毒劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率升高。本研究添加的抑制劑均能降低褐化率，其中，添加聚乙烯吡咯烷酮的處理外植體褐化率最低。低溫處理可以明顯降低川貝母組織培養(yǎng)過(guò)程的褐化率，這與王躍華等[19]和趙伶俐等[20]的結(jié)論一致。綜上，考慮川貝母組培苗的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展方向，以鱗莖作為川貝母組織培養(yǎng)外植體，采用HgCl2和次氯酸鈉消毒滅菌8 min，置于添加PVP的培養(yǎng)基中，于光照周期8 h·d-1、溫度(25±2)℃，暗周期16 h·d-1、溫度(15±2)℃條件下培養(yǎng)，能夠較好地控制川貝母鱗莖組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化率，同時(shí)提高組培植株的獲得率。

本研究發(fā)現(xiàn)，川貝母外植體接種20 d之后才會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，增殖階段的褐化率高于前期，而變溫培養(yǎng)能夠明顯推遲褐化的發(fā)生，降低褐化率，同時(shí)促進(jìn)川貝母鱗莖的組織培養(yǎng)過(guò)程，并且溫度的變化對(duì)川貝母外植體褐化控制的影響程度較其他因素明顯。筆者也對(duì)培養(yǎng)基成分、濃度、外植體種類進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的成分和濃度對(duì)川貝母鱗莖的褐化率影響較??；以莖段、葉片、針形幼苗作為外植體均不同程度出現(xiàn)褐化，褐化率差異不明顯，而誘導(dǎo)率差異較明顯。本研究中空白對(duì)照組的褐化率也不低，推測(cè)是由于對(duì)外植體的切割處理造成了傷口，而傷口的存在會(huì)提高褐化出現(xiàn)的概率[9]，因此，后期可以考慮使用完整鱗莖接種進(jìn)行組織培養(yǎng)，以降低褐化概率。