郭德斌，蘇婷，郭振，毛春財(cái)，盧素珍，王輝*

(1.江西煌上煌集團(tuán)食品股份有限公司，江西 南昌 330200； 2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

鴨肉具有大補(bǔ)消熱、利便除腫、消脹利臟等功效，一直是餐桌上的上乘佳肴。鴨肉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)比畜肉高，脂肪、碳水化合物含量適中[1]。另外，鴨皮中含有豐富的膠原蛋白，是美容養(yǎng)顏、滋陰補(bǔ)腎的佳品。據(jù)報(bào)道，鴨皮膠原蛋白的氨基酸組成和比例非常優(yōu)越，羥脯氨酸含量較高，且膠原蛋白的結(jié)構(gòu)與人體膠原蛋白結(jié)構(gòu)比較相似，是生產(chǎn)膠原蛋白的最佳原料[2]。

目前，膠原蛋白質(zhì)的提取技術(shù)主要有酸法[3]、堿法、酶法、水提法等等，其中酸法、堿法和水提法的反應(yīng)條件比較劇烈，易使蛋白質(zhì)上的氨基酸發(fā)生其他副反應(yīng)，影響膠原蛋白的品質(zhì)。酶法具有效率高、反應(yīng)溫和、不破壞蛋白質(zhì)的原始氨基酸結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)[4]，被廣泛用于膠原蛋白的提取。鴨肉制品的加工是我國(guó)的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，在全國(guó)各地均有較多的消費(fèi)群體，但是關(guān)于鴨骨、鴨皮、鴨皮中膠原的研究較少，僅有鴨骨成分和鴨骨糜加工等方面的研究報(bào)道[5]。肉鴨加工中還會(huì)產(chǎn)生鴨皮等副產(chǎn)物，僅伊莉等[3]研發(fā)了酸法提取鴨皮膠原蛋白的工藝和技術(shù)。本文以鴨皮為主要原料，以水解度和抗氧化活性為指標(biāo)篩選最佳蛋白酶，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究鴨皮膠原蛋白肽的最佳制備工藝，并進(jìn)行分子質(zhì)量和抗氧化活性分析，為鴨皮的高值化綜合利用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨皮來(lái)源于江西煌上煌集團(tuán)食品股份有限公司。2.4 L Alcalase堿性蛋白酶購(gòu)于丹麥諾維信公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

U-2910紫外/可見分光光度計(jì)(日本日立公司)；Synergy H1酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；TGL-10C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；TP-214型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；Agilent 1100 HPLC(美國(guó)安捷倫科技技術(shù)有限公司)；B-260型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 鴨皮的粉碎和脫脂處理

將新鮮鴨皮清洗干凈，采用膠體磨進(jìn)行鴨皮的粉碎，得到鴨皮糜，然后以低沸點(diǎn)正己烷為提取劑，采用溶劑脫脂技術(shù)進(jìn)行鴨皮糜的脫脂，使脂肪殘留量低于5%(占干物質(zhì)量)。

1.2.2 最適蛋白酶的選擇

通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)、市場(chǎng)銷售和工藝需求，分別從表1的4種蛋白酶中進(jìn)行最適蛋白酶的選擇，比較不同酶對(duì)鴨皮糜的水解度，水解度最高的酶為最適合酶。

表1 最適蛋白酶的酶解條件

1.2.3 鴨皮中膠原多肽的提取

以脫脂后的鴨皮糜為原料，按照一定的料液比加入去離子水，在一定溫度和pH值條件下采用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，以水解度為主要指標(biāo)，以料液比、溫度、pH值、酶添加量和時(shí)間為主要影響因素，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定鴨皮中膠原多肽的最佳提取工藝。

單因素試驗(yàn)：液料比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30；加酶量分別為4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 U·g-1；溫度分別為50、55、60、65、70 ℃；pH值分別為7、7.5、8.0、8.5、9.0；水解時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：1、2、3水平的酶解溫度(A)分別為55、60、65 ℃，液料比(B)分別為1∶18、1∶20、1∶22，加酶量(C)分別為6 500、7 000、7 500 U·g-1，pH(D)分別為8.0、8.5、9.0。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

采用甲醛滴定法[6]測(cè)定水解度。

將最佳工藝制備得到的鴨皮膠原多肽溶于去離子水，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，采用高效體積排阻色譜法測(cè)定分子質(zhì)量[7]。

羥自由基(·OH)清除能力的測(cè)定。分別取1.0 mL不同濃度的鴨皮膠原肽溶液加入5 mL的具塞試管中，然后依次分別加入硫酸亞鐵(2 mL，1.8 mmol·L-1)、水楊酸-乙醇(1.5 mL，1.8 mmol·L-1)、H2O2(0.1 mL，8.8 mmol·L-1)，37 ℃孵化30 min；然后取200 μL反應(yīng)液于96孔的酶標(biāo)板上測(cè)量波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值Di，空白樣品為去離子水樣品，吸光度值為D0。羥自由基清除率(%)[8]=[(D0-Di)/D0]×100。

還原力的測(cè)定。分別取2.0 mL不同濃度的多肽溶液移入10 mL的具塞比色管中，然后依次加入2 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1，pH值6.6)、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3Fe(CN)6，混合均勻，于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，然后冷卻至室溫。隨后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，混勻離心后取2 mL上清液，加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1% FeCl3，混勻后于700 nm處測(cè)定Di。以去離子代替樣品作為對(duì)照[9]。

DPPH清除能力測(cè)定。分別取100 μL不同濃度的膠原多肽移至96孔酶標(biāo)板，然后加100 μL 0.2 mmol·L-1的DPPH的乙醇溶液，混勻，在常溫條件下避光反應(yīng)30 min，波長(zhǎng)517 nm處測(cè)吸光度值D1。以95%乙醇代替DPPH溶液作為空白對(duì)照1(D0)，以去離子水代替膠原多肽為對(duì)照組2(D2)。DPPH清除率(%)[10]=(D2-D1)/(D2-D0)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

水解度和抗氧化活性是衡量膠原多肽制備效率和產(chǎn)品效果的2個(gè)主要指標(biāo)[10]。本研究選擇具有較強(qiáng)活性的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶為主要水解酶，4種蛋白酶對(duì)鴨皮膠原多肽的水解效果和抗氧化活性如圖1所示，堿性蛋白酶的酶解效率較高，且水解樣品的羥自由基清除率、DPPH清除率和還原力均高于其他3種水解酶。因此，本試驗(yàn)以堿性蛋白酶為最佳水解酶開展后續(xù)試驗(yàn)。

同指標(biāo)柱上無(wú)相同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)鴨皮膠原水解度的影響

料液比是影響鴨皮膠原蛋白水解的重要因素之一。如圖2所示，隨著料液比的增大，鴨皮膠原蛋白的水解度呈增加的趨勢(shì)，且當(dāng)料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25和1∶30時(shí)，其水解度變化不顯著。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有2個(gè)，一方面鴨皮糜本身含有一定的水分，料液比1∶15的條件下剛好使鴨皮糜達(dá)到最佳料液比；另一方面，在該條件下酶可以充分地與底物膠原蛋白接觸和反應(yīng)，物料濃度太高時(shí)，酶與底物不能充分接觸，物料濃度太低時(shí)，酶與底物的接觸面積也會(huì)相對(duì)減少[11]。

圖2 料液比對(duì)鴨皮膠原蛋白水解度的影響

2.2.2 加酶量、溫度對(duì)鴨皮膠原水解度的影響

加酶量和溫度是鴨皮膠原水解的重要因素。由圖3可知，酶的添加量與水解度成正相關(guān)，隨著酶添加量的不斷增加，鴨皮膠原的水解度顯著提高，當(dāng)酶加入量超過(guò)7 000 U·g-1后，水解度無(wú)顯著變化，此時(shí)的反應(yīng)達(dá)到平衡。主要是由于底物-酶的結(jié)合有一個(gè)最佳飽和度，當(dāng)未達(dá)到飽和時(shí)，隨著酶添加量增加，水解度逐漸提高；當(dāng)二者達(dá)到飽和時(shí)，酶的添加量對(duì)其水解度的影響減小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，在蛋白質(zhì)酶解初期，底物和酶之間的相互作用達(dá)到飽和，但是，隨著酶添加量的增加，大部分反應(yīng)底物被消耗，而使其水解度降低。因此，選取試驗(yàn)酶加入量的3個(gè)水平因素為5 000、6 000、7 000 U·g-1。隨著溫度的增加水解度呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)水解溫度為60 ℃時(shí)，其水解度達(dá)到最大值，說(shuō)明底物為鴨皮糜時(shí)，60 ℃為堿性蛋白酶的最佳酶解活性。

2.2.3 pH值和酶解時(shí)間對(duì)鴨皮膠原水解度的影響

由圖4可知，pH值從7增加到9時(shí)，水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為8.5時(shí)水解度達(dá)到最大。而隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度不斷提高。酶解時(shí)間為1、2 h時(shí)，水解度的升高速度最快，因?yàn)榈鞍酌冈谇捌诨钚宰罡撸庑室沧罡摺．?dāng)時(shí)間超過(guò)5 h時(shí)，水解度無(wú)顯著變化，這是因?yàn)楫?dāng)水解時(shí)間為1～5 h時(shí)，鴨皮膠原蛋白呈飽和狀態(tài)，水解反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)向產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)5 h，反應(yīng)達(dá)到平衡，加上5 h以后蛋白酶的活性降低也會(huì)影響其水解度。

圖3 加酶量和溫度對(duì)鴨皮膠原蛋白水解度的影響

圖4 pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)鴨皮膠原蛋白水解度的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

鴨皮膠原蛋白水解過(guò)程中的各個(gè)影響因素不是孤立發(fā)生的，是具有一定的相互關(guān)聯(lián)性的。因此，要得到鴨皮膠原蛋白制備的最佳工藝，必須進(jìn)行酶添加量、料液比、反應(yīng)溫度、時(shí)間和pH等各個(gè)因素正交試驗(yàn)[12]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇固定酶解時(shí)間，進(jìn)行料液比、酶解溫度、加酶量、pH值4個(gè)因素的正交試驗(yàn)。由表2和極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)鴨皮中膠原蛋白水解度的影響大小為溫度>料液比>pH>加酶量。鴨皮膠原水解的最佳工藝為溫度60 ℃，料液比為1∶20，加酶量7 000 U·g-1，pH 8.5，反應(yīng)4 h，此時(shí)水解度為22.14%。

表2 各處理組合對(duì)水解度的影響

2.4 鴨皮膠原蛋白肽的抗氧化活性和相對(duì)分子質(zhì)量分析

采用上述最佳工藝條件制備鴨皮膠原蛋白肽，并進(jìn)行其抗氧化和分子質(zhì)量分析。如圖5所示，隨著多肽濃度增加，其抗氧化活性逐漸增大，當(dāng)添加濃度為16 mg·mL-1時(shí)，其羥自由基清除能力、DPPH清除能力和還原力分別為65.22%、77.45%和79.36%。

圖5 鴨皮膠原蛋白肽的抗氧化活性分析

利用分子排阻凝膠柱進(jìn)行鴨皮膠原多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分析，通過(guò)HPLC色譜中的出峰時(shí)間、面積，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)保留時(shí)間作圖(圖6)，得到相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程，計(jì)算得出鴨皮膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量為1 000～5 000 u，該組分占83.56%；1 000 u以下的多肽占16.44%。

圖6 鴨皮膠原蛋白肽相對(duì)分子質(zhì)量分析的HPLC圖譜

3 小結(jié)

本研究以鴨皮糜為原料，篩選了堿性蛋白酶作為鴨皮糜中膠原蛋白肽提取的主要蛋白酶，并以水解度為主要指標(biāo)，確定了鴨皮膠原肽制備的最佳工藝條件為：溫度60 ℃，料液比為1∶20，加酶量7 000 U·g-1，pH值 8.5，反應(yīng)4 h，此時(shí)水解度為22.14%。

本文工藝制備得到的鴨皮膠原肽具有一定的抗氧化能力，當(dāng)添加濃度為16 mg·mL-1時(shí)，其羥自由基清除能力、DPPH清除能力和還原力分別為65.22%、77.45%和79.36%；其相對(duì)分子質(zhì)量為1 000～5 000 u，該組分占83.56%，1 000 u以下的多肽占16.44%。