張 晗，高 星，宣仕芬，徐大倫，張進(jìn)杰，錢云霞，楊文鴿*

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動物蛋白食品精深加工重點實驗室，浙江 寧波 315211 ）

鱸魚（Lateolabrax japonicus）是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，2016年全國海水鱸魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)12.25萬 t[1]，鱸魚肉因其高蛋白低脂肪及鮮美的滋味而備受人們喜愛，然而新鮮鱸魚肉容易腐敗，因此，延長其貨架期十分必要。電子束輻照作為新型的冷殺菌方式，常用于農(nóng)畜產(chǎn)品及水產(chǎn)品的殺菌保鮮。楊文鴿等[2]采用電子束輻照處理鮮牡蠣，發(fā)現(xiàn)1～5 kGy輻照抑菌效果明顯，可延長貨架期4～8 d；Alahakoon等[3]研究電子束輻照結(jié)合柑橘提取物對雞胸肉的影響，結(jié)果表明輻照后雞胸肉的菌落總數(shù)明顯減少。近年來電子束輻照在鱸魚保鮮方面的應(yīng)用亦逐漸開展，如鉏曉艷等[4]發(fā)現(xiàn)鱸魚肉經(jīng)低于4.41 kGy的電子束輻照，能最大限度保持其感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu)特性；本實驗室亦采用電子束輻照處理鱸魚肉，發(fā)現(xiàn)冷藏前經(jīng)3～5 kGy輻照，能降低1～2 個數(shù)量級的菌落總數(shù)，延長鱸魚肉貨架期6～10 d[5]。

然而，輻照在殺滅微生物、延長食品保質(zhì)期的同時，也能作用于蛋白等生物大分子而引起肌肉蛋白質(zhì)化學(xué)作用力、生化特性的改變，導(dǎo)致蛋白變性或凝膠化。Shi Yan等[6]采用γ射線輻照處理魚肉，發(fā)現(xiàn)隨著輻照劑量的增加，肌球蛋白重鏈含量逐漸減少，當(dāng)輻照劑量達(dá)到8 kGy時，肌球蛋白重鏈徹底消失，并推測與輻照引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)有關(guān)；陳茜茜等[7]發(fā)現(xiàn)輻照后牛肉蛋白的羰基含量明顯增加，認(rèn)為輻照促進(jìn)了蛋白質(zhì)的氧化；Cie?la等[8]研究表明輻照后牛奶蛋白在酰胺I帶的吸收峰有明顯的紅移現(xiàn)象。肌原纖維蛋白作為魚肉蛋白重要的組成部分，其生化特性及其結(jié)構(gòu)的變化與蛋白的功能特性、魚肉品質(zhì)密切相關(guān)。因此，采用輻照保鮮魚肉的同時，關(guān)注輻照劑量對肌原纖維蛋白生化特性及其結(jié)構(gòu)的影響亦十分重要。本實驗以新鮮海鱸魚（Lateolabrax japonicus）肉為原料，通過不同劑量電子束輻照處理，分析輻照對魚肉肌原纖維蛋白鹽溶蛋白含量、巰基含量、二硫鍵含量、Ca2+-ATPase活力、表面疏水性以及蛋白羰基含量的影響，并結(jié)合圓二色光譜分析蛋白二級結(jié)構(gòu)，在分子水平探討輻照對肌原纖維蛋白生化特性的影響機(jī)理，為輻照技術(shù)在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活海鱸魚（Lateolabrax japonicu）購于寧波路林水產(chǎn)市場，共50 條，每條體質(zhì)量約500 g，體長約35 cm?；铘~宰殺后去除頭、尾、內(nèi)臟，清洗干凈后沿脊柱分為兩半。鱸魚肉每包300 g，真空包裝備用。

Tris-馬來酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic a c i d，E D TA）、5,5’-二硫代2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍 上海阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Biofuge Stratos型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Thermo Scientific Sorval公司；BP221S電子分析天平德國Sartorius公司；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；J-1500型圓二色光譜儀 Jasco日本分光株式會社；NBL-1010型電子直線加速器寧波超能科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚肉的電子束輻照處理

采用NBL-1010型電子直線加速器（能量10 MeV、劑量率1 kGy/s）對鱸魚肉進(jìn)行輻照處理，劑量分別為0、1、3、5、7 kGy，其中0 kGy為對照組。為保證輻照均勻性，魚肉單包排列。各劑量設(shè)置3 組平行，輻照后立即取樣檢測各項指標(biāo)。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取與含量測定

參考林嫻萍等[9]的方法稍作修改。取2 g鱸魚肉，加入10 倍體積緩沖液A（20 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來酸、0.05 mol/L KCl），勻漿，10 000 r/min離心15 min，沉淀用緩沖液A洗滌2 次。沉淀加入15 倍體積緩沖液B（20 mmol/L pH 7.0 Tris-馬來酸、0.6 mol/L KCl），勻漿后浸提60 min，10 000 r/min離心15 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液，采用雙縮脲法測定蛋白含量。

1.3.3 總巰基和活性巰基含量的測定

根據(jù)Benjakul等[10]的方法稍作修改。取1 mL肌原纖維蛋白溶液，加9 mL Tris-HCl（含8 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%十二烷基硫酸鈉、10 mol/L EDTA，pH 6.8），混勻后取4 mL加0.4 mL 0.1% DNTB溶液（DNTB溶于0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），40 ℃水浴25 min，于412 nm波長處測吸光度。用0.6 mol/L KCl替代樣品，作為空白。活性巰基含量測定時，采用不含尿素的Tris-HCl，其余操作均同上。以摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算巰基含量。

1.3.4 二硫鍵含量的測定

根據(jù)Thannhauser等[11]的方法測定二硫鍵含量。

1.3.5 表面疏水性的測定

現(xiàn)代企業(yè)制度的建立是基于設(shè)備管理基礎(chǔ)上的，設(shè)備全過程的管理包括了人員組織、技術(shù)應(yīng)用以及經(jīng)濟(jì)總體功能等內(nèi)容，實現(xiàn)了無形價值理念與具體設(shè)備實物管理的結(jié)合，讓企業(yè)對設(shè)備的高效實用與管理奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)Chelh等[12]的方法稍作修改，以溴酚藍(lán)結(jié)合量表征肌原纖維蛋白的表面疏水性，兩者呈正相關(guān)。用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）將肌原纖維蛋白稀釋至2 mg/mL。取1 mL肌原纖維蛋白溶液，加入1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液200 μL，混合均勻，25 ℃下反應(yīng)10 min，3 000 r/min離心15 min，將上清液稀釋10 倍，于595 nm波長處測吸光度。以磷酸鹽緩沖液作為空白。溴酚藍(lán)結(jié)合量按下式計算。

式中：A0為空白吸光度；A為樣品吸光度。

1.3.6 Ca2+-ATPase活力的測定

采用Thanonkaew等[13]的方法測定，結(jié)果以每分鐘生成1 μmol磷所需的酶量為一個活力單位，單位為μmol/（mg·min）。

1.3.7 蛋白羰基含量的測定

參照Oliver等[14]的方法，并稍作修改。取1 mL肌原纖維蛋白溶液，加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼，室溫下在暗處靜置1 h，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸，10 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）清洗3 次，加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃水浴15 min，10 000 r/min離心5 min，于370 nm波長處測吸光度。以摩爾吸光系數(shù)2 200 L/（mol·cm）計算蛋白羰基含量。

1.3.8 圓二色光譜測定

參照楊玉玲等[15]的方法略作修改。提取的肌原纖維蛋白用緩沖液B稀釋至0.2 mg/mL進(jìn)行圓二色光譜檢測。掃描光譜范圍190～240 nm，比色皿直徑1 mm，測定溫度25 ℃，掃描速率50 nm/min，響應(yīng)時間0.25 s，光譜重復(fù)掃描3 次，累加得到圓二色光譜圖。以緩沖液B為空白，利用儀器自帶軟件分析肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)單元的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗設(shè)3 個平行，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分別采用SAS 9.1.3和Origin 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白鹽溶性的影響

圖1 輻照劑量對魚肉鹽溶蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of irradiation dose on salt-soluble protein content of fi sh meat

蛋白溶解性常用于表示蛋白質(zhì)交聯(lián)和聚集的程度，在一定程度上可表征蛋白的氧化程度。由圖1可知，當(dāng)輻照劑量為3 kGy及以下時，肌原纖維蛋白鹽溶性無顯著變化（P＞0.05），當(dāng)輻照劑量繼續(xù)上升時，鹽溶蛋白含量顯著下降（P＜0.05）。魚肉蛋白的功能特性主要取決于肌原纖維蛋白，蛋白質(zhì)的變性會使其溶解性下降，從而使鹽溶蛋白含量減少[16]。高劑量輻照使鹽溶蛋白含量減少，原因可能是由于輻照能使肌原纖維蛋白發(fā)生氧化變性[17-18]，且輻照劑量越高，這種氧化現(xiàn)象越明顯，導(dǎo)致蛋白鹽溶性顯著降低。

2.2 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白巰基及二硫鍵含量的影響

由圖2可知，隨著輻照劑量的增加，總巰基含量呈先上升后下降的趨勢。與對照組相比，1 kGy與3 kGy輻照組肌原纖維蛋白的總巰基含量顯著增加，活性巰基含量無顯著差異（P＞0.05），而當(dāng)輻照劑量為5 kGy和7 kGy時，總巰基和活性巰基含量均開始下降，并且顯著低于1、3 kGy輻照組和對照組（P＜0.05）。相較于對照組，1 kGy輻照后肌原纖維蛋白中二硫鍵含量略有上升，但并不明顯（P＞0.05），隨著輻照劑量的增加，二硫鍵含量亦呈現(xiàn)繼續(xù)上升的趨勢。兩個巰基被氧化形成的共價鍵即為二硫鍵，從圖2可以看出，巰基含量的下降伴隨著二硫鍵含量的上升，說明一定劑量的輻照會加速蛋白質(zhì)氧化變性。輻照能暴露部分包埋于蛋白分子內(nèi)部的巰基，低劑量組巰基含量的上升可能是由于分子內(nèi)部巰基的暴露，然而電子束輻照又會促進(jìn)魚肉中的水等小分子物質(zhì)發(fā)生電離，產(chǎn)生羥自由基等促進(jìn)巰基的氧化，高劑量組巰基含量的顯著下降伴隨著二硫鍵含量的顯著上升，這與羥基自由基的產(chǎn)生、暴露出的巰基更容易被氧化有關(guān)[19-21]。Jaczynski等[22]研究輻照對狹鱈魚魚糜凝膠肌原纖維蛋白巰基含量的影響，結(jié)果表明總巰基和活性巰基含量在0～6 kGy均隨輻照劑量的增大而增加，當(dāng)輻照劑量大于6 kGy時逐漸減小，這與本實驗結(jié)果類似；王寧等[23]在研究輻照對牛肉蛋白影響時亦得到類似結(jié)果。結(jié)合圖1、2，鹽溶蛋白和巰基含量的下降均出現(xiàn)在輻照劑量大于3 kGy，認(rèn)為肌原纖維蛋白鹽溶性的下降與其巰基被氧化密切相關(guān)。

圖2 輻照劑量對肌原纖維蛋白巰基及二硫鍵含量的影響Fig. 2 Effect of irradiation dose on sulfhydryl and disulfide bond content of myofibrillar protein

2.3 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力的影響

圖3 輻照劑量對肌原纖維蛋白Ca2-ATPase活力的影響Fig. 3 Effect of irradiation dose on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein

Ca2+-ATPase活力是評價肌動球蛋白完整性的良好指標(biāo)，蛋白質(zhì)的變性會引起其酶活力的改變。如圖3所示，1 kGy輻照組肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力為0.0 2 6 2 μ m o l/（ m g· m i n） ， 與 對 照 組0.026 1 μmol/（mg·min）無顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)輻照劑量上升至3 kGy時，Ca2+-ATPase活力顯著下降至0.022 9 μmol/（mg·min）（P＜0.05）。隨著輻照劑量的繼續(xù)上升，Ca2+-ATPase活力繼續(xù)下降，7 kGy輻照組僅為0.021 0 μmol/（mg·min）。Ca2+-ATPase的活性中心位于肌球蛋白頭部[24]，Ca2+-ATPase活力的下降可能是輻照使肌球蛋白的球狀頭部構(gòu)型發(fā)生改變引起的。此外，有學(xué)者認(rèn)為，由于巰基氧化產(chǎn)生二硫鍵使分子聚合，也會導(dǎo)致ATPase活力的下降。本研究中，Ca2+-ATPase活力的下降與Li Yanqing等[25]的發(fā)現(xiàn)相似，高劑量的輻照破壞了肌動球蛋白的完整性，使肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力發(fā)生不同程度的下降。

2.4 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖4 輻照劑量對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig. 4 Effect of irradiation dose on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

當(dāng)?shù)鞍讟?gòu)象發(fā)生變化，包埋于分子內(nèi)部的一些疏水性氨基酸殘基會暴露于分子表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生變化。如圖4所示，電子束輻照后，鱸魚肉肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并于5 kGy時達(dá)到最大值。表面疏水性的上升是由于肌原纖維蛋白受到輻照后發(fā)生氧化，一些疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白分子表面。此外，輻照所產(chǎn)生的自由基通過攻擊氨基酸側(cè)鏈而影響肌原纖維蛋白的表面疏水性，當(dāng)輻照劑量高至7 kGy時，表面疏水性顯著下降（P＜0.05），原因在于高劑量的輻照使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，暴露在表面的疏水基團(tuán)又被重新包埋，引起表面疏水性下降[26]。An等[27]采用輻照處理過氧化物酶蛋白，其表面疏水性也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，且在5 kGy時達(dá)到最大值。

2.5 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

圖5 輻照劑量對肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig. 5 Effect of irradiation dose on carbonyl content of myofibrillar protein

羰基含量是衡量肌肉蛋白氧化的重要指標(biāo)之一，羰基的形成途徑有兩種：通過多肽主鏈的斷裂[28]和氨基酸側(cè)鏈的直接氧化[29]，或通過美拉德反應(yīng)以及非蛋白羰基化合物的共價結(jié)合[30]形成。輻照后，鱸魚肉肌原纖維蛋白羰基含量的變化如圖5所示。與對照組相比，除1 kGy輻照組羰基含量無顯著性變化外（P＞0.05），3、5、7 kGy輻照樣品肌原纖維蛋白羰基含量均顯著上升（P＜0.05），這一結(jié)果與電子束輻照對鱸魚肉脂質(zhì)氧化指標(biāo)硫代巴比妥酸值的影響[5]一致。通過輻照產(chǎn)生的自由基攻擊蛋白肽鏈，使氨基酸側(cè)鏈—NH或—NH2發(fā)生修飾而轉(zhuǎn)化為羰基，且輻照劑量越高，輻解產(chǎn)生的自由基也越多[31]，肌原纖維蛋白更易受到攻擊而發(fā)生氧化。Riebroy等[32]采用0、2、6 kGy γ輻照處理鯛魚蛋白也得到了類似的結(jié)果，輻照鯛魚蛋白羰基含量明顯高于對照組，且劑量越大，羰基含量越高。

2.6 電子束輻照劑量對鱸魚肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖6 肌原纖維蛋白的圓二色光譜圖Fig. 6 CD spectrum of myofibrillar protein

圖7 輻照劑量對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響Fig. 7 Effect of irradiation dose on secondary structure contents of myofibrillar protein

圓二色光譜借助于光學(xué)活性物質(zhì)在左右旋偏振光照射下表現(xiàn)出的偏振光之差分析分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息，是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的一個重要工具。蛋白質(zhì)的圓二色性主要來源于酰胺鍵的相互作用，因此常于190～250 nm波長范圍內(nèi)測量其圓二色光譜[33-34]。圖6為輻照前后鱸魚肉肌原纖維蛋白圓二色光譜圖，經(jīng)分析得到的二級結(jié)構(gòu)含量如圖7所示。在天然狀態(tài)下，蛋白質(zhì)以特定形狀的折疊態(tài)類球狀分子存在，當(dāng)發(fā)生變性時，其折疊狀態(tài)會逐漸打開。輻照所產(chǎn)生的自由基可能會對蛋白肽鏈以及氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行攻擊，從而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。從圖7可以看出，輻照后鱸魚肉肌原纖維蛋白中α-螺旋含量的下降伴隨著β-折疊含量的增加，而β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲含量無顯著變化（P＞0.05）。與對照組相比，1 kGy輻照組肌原纖維蛋白的α-螺旋和β-折疊含量僅有微小變化，表明1 kGy輻照對肌原纖維蛋白構(gòu)象無明顯的改變，這與1 kGy輻照組肌原纖維蛋白除總巰基含量外其他生化指標(biāo)均無顯著變化相一致。隨著輻照劑量繼續(xù)上升，肌原纖維蛋白的α-螺旋含量下降，β-折疊含量增加，說明高劑量輻照會促進(jìn)肌原纖維蛋白中的α-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，相比于緊密的α-螺旋構(gòu)象，β-折疊結(jié)構(gòu)的肽鏈在空間的排列更加伸展，使位于分子內(nèi)部的—SH等活性基團(tuán)和疏水基團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性，從而影響了肌原纖維蛋白的生化特性，且高劑量的輻照對蛋白特性的影響更大。肌原纖維蛋白生化特性的改變對魚肉的質(zhì)構(gòu)特性會帶來一定影響，隨著輻照劑量的增加，魚肉的硬度略微上升，彈性、咀嚼性和回復(fù)性則有所下降，其中咀嚼性在輻照劑量達(dá)到3 kGy及以上時顯著下降[5]。

3 結(jié) 論

電子束輻照對鱸魚肉進(jìn)行保鮮的同時，亦會引起魚肉肌原纖維蛋白的氧化變性。電子束輻照后，鱸魚肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，隨著輻照劑量的上升，

α-螺旋含量減少，β-折疊含量逐漸增加，肌原纖維蛋白肽鏈在空間的排列更加舒展，暴露了部分包埋在分子內(nèi)部的活性基團(tuán)和疏水基團(tuán)，從而影響了肌原纖維蛋白的生化特性。與對照組相比，1 kGy輻照組鱸魚肉肌原纖維蛋白除總巰基含量外各指標(biāo)無顯著性變化，3 kGy輻照組肌原纖維蛋白鹽溶性和巰基含量與1 kGy組無顯著差異，而5 kGy和7 kGy輻照組魚肉蛋白鹽溶性、巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性、蛋白羰基含量以及Ca2+-ATPase活力均發(fā)生顯著變化。輻解產(chǎn)生的自由基能加速肌原纖維蛋白的氧化變性，而這些變化都將影響肌原纖維蛋白的功能及鱸魚肉的品質(zhì)。因此，利用電子束輻照保鮮魚肉，應(yīng)結(jié)合保鮮效果選擇較低劑量進(jìn)行輻照處理。