王力軍 ，王鏡媛 ，郭 菲 ，王紫怡 ，宋瑞雯

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300308；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院，天津 301617）

機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙即膿毒癥，進(jìn)一步可發(fā)展為膿毒性休克，膿毒癥病死率約30%～50%[1-2]。目前膿毒癥發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。分子標(biāo)志物是膿毒癥研究熱點(diǎn)，但尚缺乏評估嚴(yán)重程度和預(yù)后的良好指標(biāo)[3]。近期研究顯示，胞外組蛋白（EH）劑量依賴性刺激炎癥介質(zhì)釋放、活化凝血、誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）形成，導(dǎo)致膿毒癥小鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷、器官功能衰竭甚至死亡[4-6]。EH由 H1、H2A、H2B、H3、H4 5種蛋白構(gòu)成[7]。輸注EH4抗體能阻斷蛋白C活化，降低小鼠病死率[4，8]。

血必凈注射液由紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等藥物組成，具有抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等功效[9]。本研究主要觀察血必凈注射液是否通過降低膿毒癥患者EH4，從而糾正凝血功能紊亂，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善病情嚴(yán)重程度，降低病死率。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象 對2017年7月—2018年6月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科收治的膿毒癥患者，采用隨機(jī)數(shù)字表，末尾為奇數(shù)者入對照組（30例），偶數(shù)者入治療組（30例）。其中對照組男18例，女12例，平均年齡（64.60±15.82）歲；治療組男 16例，女14例，平均年齡（65.08±14.68）歲。兩組間在年齡及性別上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有可比性。所有患者（或家屬）均告知此研究的目的、研究程序以及參加此研究的利弊，簽署知情同意書。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審核通過（IRB2018-152-01）。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 序貫器官衰竭評估評分（SOFA），見表1。各系統(tǒng)分?jǐn)?shù)之和即為該患者SOFA分值。在感染的基礎(chǔ)上，△SOFA分值≥2分；或快速SOFA分值≥2分時(shí)即為膿毒癥[1]。符合此標(biāo)準(zhǔn)者即為納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 病例排除標(biāo)準(zhǔn) 1）年齡＞80歲或＜18歲。2）腫瘤。3）失代償性肝硬化。4）急性壞死性胰腺炎。5）慢性終末期腎病。6）孕婦。7）免疫性疾病活動期。8）凝血功能障礙（血小板＜50×109/L、凝血酶原時(shí)間＞16 s或纖維蛋白原＜1.0 g/L）。9）不能完成該試驗(yàn)者。

1.4 治療方法 兩組患者均按照膿毒癥相關(guān)指南進(jìn)行治療。治療組在此基礎(chǔ)上，每日靜脈靜滴0.9%NaCl 100 mL+血必凈注射液100 mL，每日2次。連續(xù)治療7 d。

表1 SOFA評分Tab.1 Sequential Organ Failure Assessment score

1.5 觀察指標(biāo) EH4：患者入院時(shí)、24 h及72 h時(shí)，抗凝管采血5 mL，4℃保存20 min后3 000 r/min離心10 min。收集血漿，-80℃保存。采用上海廣銳生物科技有限公司提供的EH4（批號20171226）檢測試劑，用酶聯(lián)免疫分析法檢測EH4水平。

血漿D-二聚體、白介素-6（IL-6）和其他指標(biāo)由本院檢驗(yàn)中心測定。計(jì)算患者入院時(shí)和72 h疾病嚴(yán)重程度急性生理與慢性健康評分（APACHE評分Ⅱ）、SOFA評分，并隨訪28 d生存狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 24.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。定性資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Spearman對EH4與白細(xì)胞、血小板、IL-6和D-二聚體進(jìn)行相關(guān)性分析。繪制ROC曲線判斷入院時(shí)EH4水平與膿毒癥預(yù)后關(guān)系，找出最佳截?cái)帱c(diǎn)，計(jì)算曲線下面積、靈敏度及特異度。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后各參數(shù)的比較 治療前兩組間EH4水平、血漿D-二聚體及IL-6水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），治療24 h時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為＜0.001、0.04和0.03）。72 h時(shí) EH4水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），血漿D-二聚體及IL-6水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表 2。

表2 兩組患者治療前后各參數(shù)的比較（x±s）Tab.2Comparison of parameters between two groups before and after treatment（x±s）

2.2 兩組患者入院時(shí)及72 h時(shí)疾病嚴(yán)重程度的比較 兩組患者入院時(shí)APACHE II和SOFA分值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。72 h時(shí)兩組間APACHE II評分和SOFA分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），見表2。

2.3 EH4水平與各參數(shù)的相關(guān)性分析 兩組患者入院時(shí)、24 h及72 h時(shí)EH4與白細(xì)胞、血小板、IL-6和D-二聚體各參數(shù)的相關(guān)性分析，見表3。

2.4 入院時(shí)EH4水平與72 h時(shí)疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 入院時(shí)EH4與膿毒癥患者72 h時(shí)APACHEⅡ分值和SOFA分值的相關(guān)系數(shù)分別為0.71和0.68，見圖1和圖2。

表3 EH4與各參數(shù)的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between EH4 and various parameters

圖1 EH4與72 h時(shí)APACHEⅡ分值相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between EH4 and APACHE II scores at 72 h

圖2 EH4與72 h時(shí)SOFA分值相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between EH4 and SOFA scores at 72 h

2.5 入院時(shí)EH4水平與膿毒癥患者預(yù)后關(guān)系 60例患者28 d時(shí)存活36例，死亡24例。存活和死亡患者入院時(shí)EH4水平分別為（466.83±25.95）和（531.92±41.94）pg/mL，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。以此值判斷膿毒癥患者預(yù)后，繪制ROC曲線。曲線下面積為0.930，最佳截?cái)帱c(diǎn)為501.92 pg/mL，此時(shí)EH4判斷膿毒癥患者預(yù)后的靈敏度為79.2%，特異度為94.4%，見圖 3。

3 討論

圖3 入院時(shí)EH4水平判斷預(yù)后的ROC曲線Fig.3 ROC curve of EH4 level at admission on predicting prognosis

膿毒癥發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。過度的炎癥反應(yīng)和凝血功能障礙是其主要發(fā)病機(jī)制，多采用抗生素、營養(yǎng)支持、血液凈化等方式治療。而中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其與正虛毒損、絡(luò)脈瘀滯有關(guān)[10]。血必凈注射液是根據(jù)“四證四法”的辨證治療原則研制的復(fù)方制劑，即活血化瘀法治療瘀血，清熱解毒法治療毒熱，扶正固本法治療正氣不足，通里攻下法治療痰濕內(nèi)阻[11]。研究表明血必凈注射液可抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、IL-6 和白介素-8（IL-8）等炎癥介質(zhì)的過度分泌[12]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其可糾正膿毒癥及嚴(yán)重膿毒癥凝血紊亂，恢復(fù)器官功能，改善血流動力學(xué)狀態(tài)及嚴(yán)重程度，降低病死率[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液能夠降低膿毒癥患者24 h時(shí)EH4水平、血漿IL-6及D-二聚體水平；降低72 h時(shí)APACHE II和SOFA評分分值，與Wang F等研究結(jié)果一致[12，16]。

3.1 EH4與膿毒癥凝血功能障礙 膿毒癥患者常伴凝血功能障礙，影響其預(yù)后[17]。EH以時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物（凝血激活的標(biāo)志物）的生成，加重凝血功能紊亂。注射EH抗體后該復(fù)合物顯著下降[18]。Dhainaut JF等[19]發(fā)現(xiàn)近乎100%的膿毒癥患者出現(xiàn)血漿D-二聚體升高，其次為蛋白C降低、凝血酶原時(shí)間及部分凝血活酶時(shí)間的延長和血小板數(shù)量下降。血漿D-二聚體在反映凝血功能障礙方面尤為重要[20-21]。Peng W等[22]發(fā)現(xiàn)血必凈注射液及EH4均可影響血漿D-二聚體，與本研究結(jié)果一致。此外，Yipp BG等[23-24]發(fā)現(xiàn)EH導(dǎo)致大量血小板聚集、凝血酶激活和纖維蛋白斑塊形成。EH尚可激活Toll樣受體（TLR），產(chǎn)生凝血酶，激活和聚集血小板，導(dǎo)致血小板數(shù)量下降。本研究發(fā)現(xiàn)EH4與血小板之間無明顯相關(guān)性，可能與樣本量小有關(guān)，見表3。

3.2 EH4與膿毒癥炎癥反應(yīng) 作為損傷相關(guān)分子模式的新成員，EH以配體受體的形式與TLR2及TLR4相互作用，通過激活其下游髓樣分化因子88（MyD88）蛋白及NF-κB信號通路，啟動和調(diào)控炎癥因子的表達(dá)及釋放[25]。EH以時(shí)間和劑量依賴性的方式誘導(dǎo)白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、白介素-10（IL-10）、白介素-18（IL-18）和及 TNF-α 的釋放[16，18，24，26]。這些標(biāo)志物在抗組蛋白治療后下降[16，27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)治療組患者24 h時(shí)血漿IL-6水平明顯低于對照組，其與EH4有較好的相關(guān)性（r=0.69）。Wang Q等[29]發(fā)現(xiàn)血必凈注射液下調(diào)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達(dá)，降低IL-6及TNFα等炎癥因子釋放。EH4及HMGB1均為內(nèi)源性損傷相關(guān)模式分子成員。推測血必凈注射液可能通過降低EH4進(jìn)而降低IL-6水平。

此外，本研究中兩組患者72 h時(shí)EH4水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與課題組既往研究的健康志愿者水平近似（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），考慮可能與EH4本身代謝有關(guān)。研究表明，盲腸穿孔結(jié)扎小鼠后6～30 h可檢測到組蛋白，峰值出現(xiàn)在8 h[30-31]。Alhamdi Y等[32]表明EH在膿毒癥后10 h開始出現(xiàn)，達(dá)峰時(shí)間為16～24 h，24 h 后逐漸下降。

4 局限性

首先，血必凈注射液治療后EH4、IL-6與血漿D-二聚體水平均下降，且EH4與IL-6、血漿D-二聚體水平具有較好的相關(guān)性，此并不能證明他們之間的因果關(guān)系。其次，炎癥反應(yīng)和凝血功能影響因素復(fù)雜，本研究中僅將IL-6和血漿D-二聚體作為炎癥反應(yīng)和凝血功能的指標(biāo)，略顯不足。

總之，膿毒癥患者EH4水平與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，死亡患者EH4水平顯著高于存活者。血必凈注射液可能通過降低EH4水平，發(fā)揮改善炎癥反應(yīng)、凝血功能紊亂和疾病嚴(yán)重程度的作用。EH4既是反映膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物標(biāo)記物，也是潛在治療靶點(diǎn)之一。