李 青，朱茂靈，美馬博史

（1.廣西南寧市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 南寧 530011；2.日本美馬產(chǎn)婦人科，北海道 函館 042-0942）

【關(guān)健詞】?jī)鋈谀遗?；移植；妊娠率；著床率；P4

在人類輔助生殖技術(shù)中，移植凍融胚胎的妊娠率已達(dá)到移植新鮮胚胎的水平，成為生殖實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)之一[1]。它不僅可解決由于OHSS或輸卵管、子宮積水等原因而不能移植新鮮胚胎的問題，同時(shí)還可對(duì)新鮮胚胎移植周期剩下的胚胎進(jìn)行保存以待將來使用，從而提高累積妊娠率。通常認(rèn)為，凍融胚胎的妊娠率主要與三個(gè)因素有關(guān)，即胚胎質(zhì)量[2-3]、胚胎冷凍解凍技術(shù)[4]及子宮容受性[5-7]。近年來，培養(yǎng)液的改進(jìn)和玻璃化冷凍技術(shù)尤其是Cryotop的廣泛應(yīng)用使前兩個(gè)問題得到了很好的解決。但是，對(duì)于子宮的容受性尚有很多問題需要探討。我們知道，在自然妊娠中，孕激素作用于子宮內(nèi)膜，對(duì)于胚胎的著床和妊娠的維持有著至關(guān)重要的作用。凍融胚胎的移植往往通過自然周期、人工周期或微刺激準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，相較于新鮮移植周期更接近自然狀態(tài)。然兒，對(duì)于這個(gè)時(shí)期需要的孕激素水平卻鮮見報(bào)導(dǎo)，且互相矛盾[8-9]。本研究旨在研究?jī)鋈谀遗咭浦伯?dāng)天P4水平與妊娠獲得的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 患者來源

本研究對(duì)在日本國(guó)美馬產(chǎn)婦人科醫(yī)院進(jìn)行凍融囊胚移植的37名患者進(jìn)行調(diào)查?；颊吣挲g在27～40歲之間，平均年齡33.4歲。所有患者均簽署了知情同意書，并通過本院倫理委員會(huì)的討論。

1.2 體外受精和培養(yǎng)

所有患者均通過長(zhǎng)方案或短方案超排取卵。授精方式為常規(guī)體外受精（IVF）或單精子顯微注射（ICSI)，授精后15～18小時(shí)觀察受精情況。確認(rèn)正常受精后將受精卵移至日產(chǎn)Irvine Scientific公司的受精培養(yǎng)液培養(yǎng)至第3天，然后轉(zhuǎn)至同公司生產(chǎn)的囊胚培養(yǎng)液。在取卵后第五天或第六天根據(jù)具體情況移植或冷凍囊胚。在冷凍前，首先對(duì)囊胚進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Gardner方法(10)。

1.3 囊胚的冷凍和解凍

囊胚的冷凍和解凍采用日本桑山報(bào)導(dǎo)的玻璃化冷凍解凍方法[4]，產(chǎn)品采用日產(chǎn)北里公司的Cryotop系統(tǒng)(Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japan)。簡(jiǎn)言之，將1～2個(gè)囊胚在平衡液里平衡8～10分鐘左右，之后轉(zhuǎn)移至冷凍液中約45～60秒，然后裝載到載桿上并快速置于液氮中。解凍時(shí)將載有囊胚的載桿浸于解凍液1分鐘、稀釋液3分鐘，然后在洗滌液中洗滌兩次，每次5分鐘。

1.4 子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備和胚胎移植

子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備需要用到E2(EstranaTape 0.72mg,Hisamitsu, Japan)、GnRH激動(dòng)劑（Buserecur, Fujiphama,Japan)和P4。在上一周期的黃體中期開始用GnRH激動(dòng)劑直至移植周期的第15天，此時(shí)開始使用P4直至妊娠鑒定。E2則于移植周期的第一天開始使用至孕檢日。對(duì)于妊娠鑒定為陽(yáng)性的患者繼續(xù)使用E2和P4。

在移植日即移植周期第20天測(cè)定血中P4濃度和子宮內(nèi)膜厚度，并于移植當(dāng)天解凍囊胚并復(fù)蘇培養(yǎng)4小時(shí)。移植前使用激光對(duì)囊胚行人工孵化。本研究只移植質(zhì)量較好的囊胚，即3BB或4BB或以上的囊胚。

1.5 妊娠鑒定

妊娠鑒定在囊胚移植后10天進(jìn)行。血中的HCG若高于20 ul/ml，則認(rèn)定為生化妊娠，在6～7周時(shí)可見胎心和胎囊則認(rèn)定為臨床妊娠。著床率的計(jì)算為胎囊總數(shù)除以移植胚胎總數(shù)。懷孕持續(xù)至20周以后則視為持續(xù)妊娠。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)分析不同孕激素水平的妊娠情況，用T檢驗(yàn)分析妊娠組與非妊娠組間孕激素水平的差異，在基數(shù)小于5的時(shí)候，則用Fish檢驗(yàn)。P值＜0.05視為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。

2 結(jié) 果

表1比較P4≥10 ng/ml和P4＜10 ng/ml兩組患者的平均年齡、周期第3天的FSH水平、不孕時(shí)長(zhǎng)和不孕原因。圖中表明，兩組的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。

表2比較P4≥10 ng/ml和P4＜10 ng/ml兩組的妊娠結(jié)果。兩組移植的胚胎數(shù)目無(wú)顯著區(qū)別，但P4≥10 ng/ml組的臨床妊娠率、著床率和持續(xù)妊娠率明顯高于P4＜10 ng/ml組。（分別為77.8% vs 10.0%，76.7% vs 9.1%，P＜0.001；66.7%vs 10.0%，P＜0.01）。其中，P4≥10ng/ml組有2例為多胎（9.5%），早期流產(chǎn)率為14.3%。

表1 比較P4＜10ng/ml和P4≥10ng/ml兩組患者的基礎(chǔ)指標(biāo)

表3表明非妊娠組在移植當(dāng)天血中P4水平顯著低于妊娠組。（11.20 pg/ml vs 19.77 pg/ml，P＜0.01)。

表3 比較非妊娠組和妊娠組在移植當(dāng)天血中的P4水平

3 討 論

早期對(duì)于恒河猴的研究表明，在排卵后2～6天即使將卵巢切除，只要補(bǔ)充足夠的P4，同樣可使胚胎著床[11]。由此可見，P4對(duì)胚胎著床起支持作用并維持妊娠。對(duì)小鼠和大鼠的研究也表明，排卵后黃體分泌的P4使子宮內(nèi)膜基層細(xì)胞增強(qiáng)。而且，P4與E2共同作用參與移植窗的建立[12]。臨床研究還表明，P4抑制子宮收縮，為胚胎種植提供良好的環(huán)境[13-14]?，F(xiàn)在，不管是鮮胚移植還是凍胚移植，移植后給予子宮內(nèi)膜補(bǔ)充P4已成為IVF治療的常規(guī)手段[15-16]。但是，對(duì)凍融胚胎進(jìn)行移植時(shí)P4在血中需要達(dá)到何種水平尚無(wú)共識(shí)。

早期的研究表明血中P4水平與妊娠的獲得無(wú)關(guān)。例如Muasher等報(bào)道在周期第17天移植時(shí)血中P4的濃度在妊娠組和非妊娠組分別為13.3 ng/ml和17.4 ng/ml，兩組之間沒有差異[17]。Irianni等報(bào)道在移植凍融胚胎的前一天、當(dāng)天血中的P4水平與妊娠獲得無(wú)關(guān)[18]。Noyes等對(duì)接受捐卵的患者在開始子宮內(nèi)膜預(yù)備的2天后進(jìn)行采樣，結(jié)果表明血中P4水平與妊娠率也無(wú)關(guān)[5]。

但是，近年的研究表明血中P4水平與妊娠的獲得存在一定的關(guān)系。Gaggiotti-Marre等報(bào)導(dǎo)，胚胎移植前一天的血中P4水平如果低于10.64 ng/ml，則活嬰出生率明顯降低[19]。接受捐卵的母體也存在同樣現(xiàn)象。在移植當(dāng)天如果血中P4水平低于20 ng/ml，將會(huì)導(dǎo)致臨床妊娠率及活嬰出生率均明顯下降[20]。Yovich等認(rèn)為移植后兩天的血中P4值更能反映子宮內(nèi)膜的狀況，因?yàn)榇藭r(shí)相當(dāng)于胚胎著床之時(shí)[8]。他們的研究結(jié)果是血中P4值在70～99 nmol/ml之間最適合胚胎著床，活嬰出生率最高，低于此值或高于此值均不利于胚胎著床。他們的解釋是血中P4值低于70 nmol/ml會(huì)使子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，高于99 nmol/ml則會(huì)使子宮內(nèi)膜發(fā)育過快，種植窗提前，從而也不利于胚胎著床[8]。Kofinas等則認(rèn)為在移植當(dāng)天（D19）如果血中P4值超過20 ng/ml已屬于過高水平，超過此值會(huì)導(dǎo)致活嬰出生率降低及流產(chǎn)率升高[9]。還有人在孕檢日對(duì)血中P4值的水平進(jìn)行測(cè)定研究。Alsbjerg等發(fā)現(xiàn)，孕檢日血中的P4值如果低于35 nmol/ml，則持續(xù)妊娠率明顯降低[21]。Basnayake等收集了多個(gè)中心前后達(dá)14年共4582個(gè)周期的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，但他們提出的閾值是50 nmol/ml，即孕檢日血中的P4水平高于此值，則活嬰出生率明顯增高[22]。

為了更準(zhǔn)確研究血中P4值對(duì)妊娠的影響，我們選擇在囊胚移植當(dāng)天即囊胚即將著床的時(shí)刻對(duì)血中P4值進(jìn)行測(cè)定，因?yàn)榇藭r(shí)的P4水平更能準(zhǔn)確反映胚胎著床時(shí)刻子宮內(nèi)膜的情況。為了排除其它因素的影響，所有囊胚的冷凍、解凍、移植各個(gè)步驟均由相同的人操作。所有患者均采用人工周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。同時(shí)，移植的胚胎均為3BB或4BB或以上的高質(zhì)量囊胚。我們的研究表明，凍融囊胚移植當(dāng)天血中P4水平與妊娠率存在正相關(guān)關(guān)系。妊娠獲得患者的血中P4水平（19.77 ng/ml）顯著高于妊娠失敗的患者（11.20 ng/ml），這個(gè)結(jié)果與Tanaka等的研究結(jié)果類似[23]。當(dāng)血中P4≥10 ng/ml時(shí)，患者獲得77.8%的臨床妊娠率，顯著高于P4＜10 ng/ml患者獲得的妊娠率（10.0%）。我們采用的閾值與Gaggiotti-Marre等提出的閾值近似，高于閾值均可明顯改善妊娠結(jié)局[19]。我們知道，妊娠的獲得不僅與子宮內(nèi)膜和胚胎質(zhì)量有關(guān)，還與很多其它因素有關(guān)。早年的研究之所以認(rèn)為血中P4水平與妊娠結(jié)局無(wú)關(guān)，可能是因?yàn)樗麄兊牟蓸訒r(shí)間與我們不同，而且那時(shí)候的妊娠率普遍較低，P4與妊娠獲得的相關(guān)關(guān)系可能被其它因素所掩蓋。

我們的研究結(jié)果表明，在移植當(dāng)天當(dāng)P4≥10 ng/ml時(shí)，臨床妊娠率達(dá)到77.8%，而P4＜10 ng/ml時(shí)臨床妊娠率突然下降至只有10.0%。我們初步推斷，根據(jù)移植當(dāng)天血中的P4水平可以預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局，血中P4是判斷子宮內(nèi)膜是否適合移植的有效指標(biāo)。本研究的局限性是樣本較少，同時(shí)是回顧性分析。今后我們打算將凍融胚胎移植的各項(xiàng)指標(biāo)納入研究范圍，探討影響妊娠結(jié)局的因素，從而為治療方案提供循證醫(yī)學(xué)根據(jù)。