于海濤，周智旋，耿正穎，陸文清

（中國農業(yè)大學動物科學技術學院，農業(yè)農村部飼料工業(yè)中心，北京 100193）

豆粕是目前應用最廣泛的植物蛋白飼料原料，其具有粗蛋白質含量高、氨基酸平衡等特點，能夠滿足動物體的蛋白質需要[1]。然而，豆粕中的蛋白質主要為β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白[2]，降低了豆粕的營養(yǎng)價值。目前，許多研究已經將蛋白酶作為降解大豆蛋白的重要手段，但最近一項研究表明，蛋白酶對大豆蛋白的體外降解并不總是降低其生物學的致敏性[3]，這意味著大豆蛋白的降解是具有蛋白酶特異性。

角蛋白酶因能降解角蛋白和高角蛋白含量的生物質（如動物毛發(fā)）而得名[4]。角蛋白酶體外酶解豆粕逐漸轉變?yōu)樯a低抗營養(yǎng)因子（β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白）豆粕的解決方案[5]。目前，角蛋白酶作為飼料添加劑在家禽和生長豬上的飼養(yǎng)效果也已經得到驗證。Wang 等[6]試驗表明，在日糧中添加0.05%的角蛋白酶能夠提高生長豬的日增重，改善其飼料轉化效率。Odetallah 等[7]研究表明，在玉米-豆粕型肉仔雞日糧中加入0.10%的角蛋白酶（薄膜超濾，凍干）能夠提高肉仔雞的生長性能，在較低蛋白水平的日糧中作用更明顯。陳乃松等[8]研究表明，低抗原大豆蛋白能夠替代水產料中的部分魚粉。近年來，角蛋白酶在仔豬上的應用研究也越來越受到關注[9-10]，但角蛋白酶促進動物生長性能的作用機制尚未明確，而豆粕是否可作為角蛋白酶的作用底物，是否因角蛋白酶降解了豆粕中的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白而降低仔豬的腹瀉率以及促進仔豬生長也尚不清楚。本試驗擬在豆粕中混入小麥麩共同作為輔料，測定角蛋白酶體外酶解后物料的營養(yǎng)物質組成，進一步探究飼糧添加酶解豆粕對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和糞便指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 耐高溫角蛋白酶賽和素?DP100（CIBENZA?DP100）由諾偉司（Novus）國際貿易（上海）有限公司提供。去皮豆粕（中國飼料號5-10-0103，去皮，浸提或預壓浸提）購自天津中糧佳悅有限公司。小麥麩購自北京益海嘉里糧油食品工業(yè)有限公司。呼吸袋（規(guī)格：20 kg 底物規(guī)模）購自北京晟亞育達生物科技有限公司。

1.2 酶解豆粕的制備 試驗在北京市平谷區(qū)的實驗基地進行，正值春季，車間平均溫度為25℃，整體環(huán)境適宜制備酶解豆粕。出于干燥工藝上的考慮，制備角蛋白酶酶解豆粕時添加了小麥麩，以達到提升物料流散性，減少干燥后物料結塊的目的。原料包括：140 kg 豆粕、60 kg 小麥麩、160 L 自來水和1.2 kg 角蛋白酶。物料混勻后平均分裝于塑料桶中，壓實后加蓋密封。酶解過程中實時監(jiān)控室內環(huán)境溫濕度、物料中心溫度和物料pH 的變化。其中，溫濕度采用溫濕度自動記錄儀進行記錄，每15 min 記錄1 次溫濕度；物料中心溫度為選取其中的一桶物料進行定點定時觀測，每20 min 記錄1 次溫度；物料pH 采用工業(yè)級的便攜式pH 計和探頭對每桶物料pH 進行不定時觀測。

1.3 試驗動物及飼養(yǎng) 管理 本試驗選用平均體重為（8.29±0.51）kg 的72 頭23 日齡斷奶、健康的杜×長×大斷奶仔豬，進行為期28 d 的飼養(yǎng)試驗。試驗于國家飼料工程技術研究中心/農業(yè)部飼料工業(yè)中心動物試驗基地（河北豐寧）進行。斷奶仔豬保育舍內溫度、濕度、通風強度、CO2和氨濃度自動化控制，試驗期間保育舍溫度維持在25～28℃。夜間加強畜舍保暖，試驗期前7 d 采用暖燈供暖。斷奶仔豬為分欄飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于1.5 m×1.5 m 的圈內，配有漏縫噴塑地板、不銹鋼可調式料槽和鴨嘴式飲水器，以粉料飼喂，自由采食和飲水。

1.4 試驗設計與飼糧 將72 頭斷奶仔豬按體重和性別進行完全隨機區(qū)組，設2 個處理，每個處理6 個重復，每個重復6 頭。對照組為玉米-豆粕型基礎飼糧，酶解豆粕組日糧含12.90%豆粕和12.50%豆粕麥麩混合型酶解豆粕。營養(yǎng)水平不低于NRC[11]生長豬營養(yǎng)需要量推薦值，其組成和營養(yǎng)成分見表1。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 飼料和試驗飼糧營養(yǎng)物質組成及抗營養(yǎng)因子檢測豆粕、麥麩、酶解豆粕以及試驗飼糧的干物質（DM）、粗蛋白質（CP）中性洗滌纖維（NDF）測定分別《飼料中干物質的測定》（GB/T 6435-2014）、《飼料中粗蛋白質的測定》（GB/T 6432-1994）、《飼料中中性洗滌纖維的測定》（GB/T 20806-2006），酸性洗滌纖維（ADF）測定按照《飼料酸性洗滌纖維的測定方法》（NY/T 1459-2007）?？偰埽℅E）按照國際標準ISO9831:1998 方法，使用氧彈氏測熱測定儀測定。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量采用大豆抗原蛋白ELISA 測定試劑盒（北京龍科方舟生物工程技術有限公司，北京）測定，相關溶液配制及操作依試劑盒說明書進行。酶解豆粕的蛋白分子量分布采用Tricine-SDSPAGE 蛋白凝膠電泳進行檢測。寡糖含量和揮發(fā)性脂肪酸含量測定采用離子色譜（ICS 3000；Thermo）。

15 種氨基酸按照《飼料中氨基酸的測定》（GB/T 18246-2000）測定。樣品在110℃條件下6 mol/L HCl水解24 h 后使用氨基酸自動分析儀（L-8900）測定。含硫氨基酸按照《飼料中含硫氨基酸測定方法》（GB/T 15399-94）測定，樣品在0℃下過鉀酸氧化16 h，在經HCl 水解24 h 后使用氨基酸自動分析儀測定。色氨酸按照《飼料中氨基酸的測定》（GB/T 18246-2000）測定，樣品用4 mol/L 氫氧化鈉在110℃條件下水解22 h 后，使用高效液相色譜儀（Agilent 1260）測定。

表 1 試驗飼糧原料和營養(yǎng)成分（飼喂基礎） %

1.5.2 生長性能 試驗第0、14、28 天早晨對每頭仔豬進行逐一稱重，稱重前一晚結料稱重，計算平均日增重（ADG）；以重復（圈）為單位記錄耗料量，試驗第14、28 天結料稱重，計算平均日采食量（ADFI）；以重復（圈）為單位，計算飼料轉化率（FCR）。計算公式：

ADG（g）=（平均末重-平均初始重）/天數(shù)

ADFI（g）=（每天投料量-次日剩料量）/該重復當天豬數(shù)

FCR = ADFI/ADG

1.5.3 腹瀉率與糞便評分 從試驗期開始，每天08:00觀察仔豬的腹瀉狀況，及時記錄。仔豬是否腹瀉主要以觀察動物個體行為狀態(tài)（如尾部沾染濕糞便、拉稀、肛門紅腫和脫水等外在表征）與圈舍漏糞板上的稀便痕跡為主。計算公式：

腹瀉率=腹瀉仔豬數(shù)/現(xiàn)存仔豬數(shù)×100%

試驗期間，每天進行糞便評分。糞便評分標準參照Pierce 等[12]所使用的方法，即：硬便，1 分；輕微軟便，2 分；部分成型的軟便，3 分；松散、半液體的糞便，4分；水樣粘液型糞便，5 分。若糞便評分為4 或5，則認為該頭豬腹瀉。

1.6 統(tǒng)計分析 各處理組腹瀉率之間的差異性分析采用卡方檢驗。其他數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 的GLM 模型中的t-test方法進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以重復為統(tǒng)計單位，若各處理組間差異顯著，則用Duncan′s 多重比較進行檢驗。統(tǒng)計結果用平均值以及標準誤來表示，P＜0.05 表示差異顯著，0.05＜P＜0.1 為有趨勢。統(tǒng)計數(shù)據(jù)的可視化采用GraphPad Prism 5.01 軟件，圖像處理采用Adobe Photoshop CS4 軟件。

2 結果與分析

2.1 飼料原料及酶解豆粕中化學成分或抗營養(yǎng)物質組成 如表2 所示，豆粕與麥麩（比例7∶3）在經過酶解加工過后，CP、GE 和DM 含量提高，而氨基酸的相對含量變化不大。與此同時，豆粕麥麩混合型酶解豆粕的NDF 含量較豆粕原料提高了近10%。豆粕原料中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白含量均為70 mg/g 左右，排除麥麩的稀釋效應后，豆粕中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的降解效率均為20%。酶解過程伴隨著自然微生物的發(fā)酵作用[13]，促使了原料中寡糖的降解和揮發(fā)性脂肪酸的產生。本試驗所用的豆粕中果糖含量最豐富。經過酶解后，酶解物料中的果糖含量由58.52 mg/g（豆粕和麥麩7∶3 混合）降解至28.05 mg/g（酶解豆粕）。與此同時，小麥麩中除了含有23.05 mg/g 果糖以外，還含有15.80 mg/g 蔗糖和0.98 mg/g 葡萄糖，小麥麩的葡萄糖含量遠高于豆粕。豆粕和小麥麩原料中揮發(fā)性脂肪酸含量較低，酶解過后主要產生乙酸、乳酸、丁酸和異丁酸。

2.2 酶解豆粕蛋白分子量分布 豆粕麥麩混合型酶解豆粕中40～50 ku 的蛋白降解比較充分（圖1）。

圖1 原料中的蛋白分子量分布

2.3 酶解豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響 由表3 可知，與對照組相比，酶解豆粕麥麩混合物增加了斷奶仔豬的28 d 體重（P＜0.05）。與對照組相比，飼糧添加酶解豆粕麥麩混合物提高了斷奶仔豬1～14 d 的生長性能（P＜0.05）。與對照組相比，飼糧添加酶解豆粕麥麩混合物提高了斷奶仔豬15～28 d 及1～28 d 的ADFI（P＜0.05），但FCR 與對照組差異不顯著。

2.4 酶解豆粕對斷奶仔豬腹瀉率和糞便評分的影響 由表4 可知，與對照組相比，飼糧添加酶解豆粕降低了斷奶仔豬1～14、15～28 d 及1～28 d 的腹瀉率和糞便評分（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 酶解豆粕和飼料原料中營養(yǎng)物質和抗營養(yǎng)物質組成本試驗中所用的豆粕原料中氨基酸、DM 以及GE 含量與文獻報道結果相吻合。Stein 等[1]對豬用飼料原料營養(yǎng)成分進行了總結，豆粕經過發(fā)酵或酶解處理過后，蛋白含量會上升，本研究中酶解物料的蛋白質干物質含量提高了4.73%。Kim 等[14]研究了不同豆粕加工方式對斷奶仔豬回腸氨基酸消化率的影響，發(fā)現(xiàn)經由枯草芽孢桿菌參與制取的發(fā)酵豆粕在提升CP 水平的同時，還具有更高的標準回腸可消化氨基酸（SIDAA）。本試驗中，日糧配方綜合考慮了酶解豆粕氨基酸消化率的變化情況，而酶解豆粕的SIDAA仍需要進一步研究。魏金濤等[15]利用木瓜蛋白酶和酵母菌在40℃條件下制取豆粕的液態(tài)酶解發(fā)酵物，其飼喂于生長育肥豬可以提高生產性能，降低糞中氮、磷、銅和鋅的排放量。酶解過程中的自然微生物發(fā)酵對物料中寡糖的降解和揮發(fā)性脂肪酸產生具有重要作用[13]。據(jù)NRC[11]報道，豆粕中的寡糖主要為蔗糖、棉籽糖和水蘇糖，而對其果糖含量關注較少。本試驗所用的豆粕具有較高的果糖含量。前期試驗結果表明，純豆粕制取的酶解豆粕中 Fructobacillus 菌能夠大量繁殖并成為優(yōu)勢菌，F(xiàn)ructobacillus 菌相比于魏斯菌更加偏好果糖而不是葡萄糖[13]。小麥麩中葡萄糖含量要明顯高于豆粕，因此這也解釋了為何魏斯菌成為豆粕麥麩混合型酶解豆粕中的優(yōu)勢菌。Fructobacillus菌相比于魏斯菌而言更偏向于發(fā)酵產乙酸，原因在于魏斯菌的乙醛/乙醇脫氫酶基因（adhE）表達量低，其在發(fā)酵過程中更偏向于產生乙醛或乙醇[16]。純豆粕型酶解豆粕偏酸，而豆粕麥麩混合型酶解豆粕則有醇香味且酸度較低。而低酸度的條件下，允許了豆粕麥麩混合型酶解豆粕中酵母菌的生長，使其進一步發(fā)酵產醇，醇香味更加豐富。

表2 試驗原料化學組成（絕干物質基礎）

表3 角蛋白酶酶解豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響

表4 酶解豆粕對斷奶仔豬腹瀉率及糞便評分的影響

3.2 酶解豆粕對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響 在日糧中添加角蛋白酶體外酶解豆粕能夠促進仔豬斷奶后28 d 內的生長。制取酶解豆粕需要6 kg/t 的角蛋白酶，換算成日糧配比，相當于在飼料配方中使用0.075%的角蛋白酶。已有研究表明，添加0.05%～0.10%的角蛋白酶對仔豬具有促生長作用[6]。然而，與對照組相比，酶解豆粕組有著更高的采食量與更低的腹瀉率和糞便評分，說明酶解豆粕對于仔豬健康有著不可忽視的促進作用。本研究結果表明，豆粕麥麩混合型酶解豆粕顯著降低了斷奶仔豬的腹瀉率和糞便評分。另一方面，豆粕麥麩混合型酶解豆粕顯著降低了豆粕中的抗營養(yǎng)因子β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的含量，從而提高酶解豆粕品質，降低斷奶仔豬的腹瀉率。

4 小 結

角蛋白酶體外酶解豆粕麥麩混合物可以降低豆粕中的抗營養(yǎng)因子β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白含量，在斷奶仔豬日糧中替代豆粕能夠提高斷奶后1～14 d 仔豬的生長性能，顯著降低整個試驗過程中斷奶仔豬的腹瀉率和糞便評分。