曹寒梅 ，楊曉莉 ，蔡 虎 ，常 春 ，傅 強(qiáng) △

（1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061； 2.陜西浩瀚管理技術(shù)咨詢(xún)有限公司，陜西 西安 710065； 3.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065； 4.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 咸陽(yáng) 712046）

中藥口服液體制劑（如合劑、糖漿劑、酒劑等）多含動(dòng)植物成分，蛋白質(zhì)和糖分含量高，且原材料中攜帶大量微生物，產(chǎn)品在生產(chǎn)、貯藏和使用過(guò)程中易受微生物污染，甚至發(fā)生霉變，故應(yīng)確認(rèn)藥物的抗菌活性。如藥品本身抑菌效力不足，應(yīng)根據(jù)制劑特性添加適宜的抑菌劑，以防止?jié)撛诘奈⑸镂廴綶1-5]。抑菌劑（也稱(chēng)防腐劑）是一類(lèi)防止或限制微生物生長(zhǎng)與繁殖的化學(xué)藥品，其主要作用是保證藥劑質(zhì)量，防止藥劑尤其是多劑量包裝制劑的微生物污染[6]。銀翹解毒合劑、止咳枇杷合劑、參術(shù)止帶糖漿均為多劑量口服制劑，使用過(guò)程中會(huì)多次打開(kāi)包裝，有被污染的風(fēng)險(xiǎn)，其處方中需添加抑菌劑，因抑菌劑有毒，故添加量應(yīng)為最低有效量[7]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)中藥制劑抑菌效力的研究較少。本研究中考察了上述3種口服液體制劑的抑菌效力是否符合衛(wèi)生安全。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、材料與試藥

儀器：LDZX-80KCS型壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）；HFsafe-1800TEⅡ，B2型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱；MJ 250FI型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；Densi CHEK Plus比濁儀（美國(guó)生物梅里埃公司）。

培養(yǎng)基及稀釋液：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供，培養(yǎng)基適用性檢查符合2015年版《中國(guó)藥典》要求。

菌種：細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10104〕和大腸埃希菌〔CMCC（B）44102〕；真菌，包括白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕和黑曲霉〔CMCC（F）98003〕。上述 5 種標(biāo)準(zhǔn)菌株均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，工作用菌株為第2代。

試藥：銀翹解毒合劑（樣品A為每瓶100 mL，抑菌劑為山梨酸，含量為0.1%）；止咳枇杷合劑（樣品B為每瓶120 mL，抑菌劑為苯甲酸鈉，含量為0.26%）；參術(shù)止帶糖漿（樣品C為每瓶210 mL，抑菌劑為苯甲酸鈉，含量為0.30%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18 h；接種白色念珠菌于SDB液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24 h；用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成試驗(yàn)所需濃度的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA瓊脂培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d或直至獲得豐富的孢子，加入3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液置無(wú)菌試管內(nèi)；用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋?zhuān)⒅瞥稍囼?yàn)所需濃度的菌懸液。

2.2 方法學(xué)考察

供試液制備：取各樣品10 mL，分別加入90 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，45℃恒溫振蕩15 min，制成 1∶10（V∶V）的供試液。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：取5種供試液，分裝于5個(gè)無(wú)菌試管中，每管裝量9.9mL，再分別加入含菌量不大于104cfu／mL的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)菌液0.1 mL。用0.1 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同法制備供試品對(duì)照組，以及不加樣品的菌液對(duì)照組。分別吸取試驗(yàn)組、供試品對(duì)照組、菌液對(duì)照組液體各1 mL，置直徑90 mm的無(wú)菌平皿中，平行2份，細(xì)菌注入約20 mL溫度不超過(guò)45℃融化的TSA培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置35℃倒置培養(yǎng)2～3 d；真菌注入約20 mL不超過(guò)45℃融化的SDA培養(yǎng)基，搖勻，凝固后置25℃倒置培養(yǎng) 3～5 d。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收率：試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表 1。各試驗(yàn)菌的回收率均在0.8～1.0范圍內(nèi)，符合要求，說(shuō)明抑菌效力試驗(yàn)中的微生物存活菌落數(shù)的測(cè)試可采用平皿法（1∶10，1 mL）進(jìn)行。

表1 計(jì)數(shù)方法適用性回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3 抑菌效力測(cè)試[8-10]

2.3.1 樣品制備

菌懸液：首先制備濃度較高、干擾較少的菌懸液。取2.2項(xiàng)下制備好的新鮮液體培養(yǎng)物銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌，離心收集菌體，采用比濁法制成每1 mL含菌數(shù)約為108cfu的菌懸液。取多份含有豐富孢子的黑曲霉瓊脂培養(yǎng)物，2.1項(xiàng)下方法制成每1 mL含孢子數(shù)約為108cfu的孢子懸液。

供試品：3種樣品均含有少量沉淀，且原包裝裝量較滿(mǎn)，開(kāi)啟后密封性不好，加入菌液不易混勻，故選在無(wú)菌瓶中試驗(yàn)。每種樣品各取3瓶，在500 mL無(wú)菌瓶中混合均勻后，無(wú)菌條件下取20 mL置無(wú)菌玻璃瓶中，按目標(biāo)菌的個(gè)數(shù)平行制備5瓶，每瓶接種制備好的5種菌懸液各0.2mL（接種菌懸液的體積不得超過(guò)供試品體積的1%），使1 mL供試品接種菌量為105～106cfu，充分混合，使供試品中的試驗(yàn)菌均勻分布。

2.3.2 初始加菌量計(jì)數(shù)

在上述“供試品”項(xiàng)下試驗(yàn)的同時(shí)，分別吸取1 mL供試品，置直徑90 mm的無(wú)菌平皿中，平行2份，按2.2項(xiàng)下方法操作及培養(yǎng)，得1 mL供試品中各試驗(yàn)菌初始加菌量。

2.3.3 試驗(yàn)方法及結(jié)果

將2.3.1項(xiàng)下含菌液供試品置25℃培養(yǎng)箱中避光貯存，依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1121“抑菌效力檢查法”項(xiàng)下抑菌效力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表，培養(yǎng)14 d和28 d時(shí)，分別取供試品各1 mL，通過(guò)梯度稀釋測(cè)定每份所含菌落數(shù)，測(cè)定細(xì)菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，測(cè)定真菌用沙式葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。根據(jù)存活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算1 mL供試品各試驗(yàn)菌所加的菌落數(shù)及各間隔時(shí)間的菌落數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 抑菌效力試驗(yàn)結(jié)果

2015年版《中國(guó)藥典（四部）》對(duì)口服液體制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)要求，培養(yǎng)14 d時(shí)，細(xì)菌lg值減少3，真菌lg值減少1；培養(yǎng)28 d時(shí)，細(xì)菌、真菌未增加（與14 d比較，試驗(yàn)菌增加數(shù)量的lg值不超過(guò)0.5）。將上述試驗(yàn)結(jié)果與判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，3種樣品對(duì)細(xì)菌的抑制結(jié)果與接菌量比較，培養(yǎng)14 d及28 d菌落數(shù)lg值下降均大于4.6，說(shuō)明該3種樣品對(duì)細(xì)菌的抑制能力較強(qiáng)，符合要求。3種樣品對(duì)真菌的抑制結(jié)果與接種菌量比較，培養(yǎng)14 d時(shí)的lg值下降均大于1.8，培養(yǎng)28 d菌落數(shù)也呈下降趨勢(shì)，未增加?？煽闯鏊幬飳?duì)真菌的抑制作用不如細(xì)菌，有少量真菌存在，但依然滿(mǎn)足要求。3種樣品抑菌劑系統(tǒng)有效，能保證藥品不易受微生物污染，安全有效，建議在處方中對(duì)防腐劑的最小有效量或?qū)ΨN類(lèi)另作考察，以確保該藥在使用過(guò)程中安全、有效。

3 討論

藥品在使用和保存過(guò)程中有可能被空氣中的微生物污染，進(jìn)而產(chǎn)生安全隱患。抑菌劑是藥物制劑中常見(jiàn)的一種附加劑，企業(yè)在開(kāi)發(fā)階段都必須確認(rèn)藥品中抑菌劑的抑菌效力。近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)制劑抑菌劑濫用問(wèn)題越來(lái)越受關(guān)注。2010年版《中國(guó)藥典》首次收載了抑菌效力檢查法，制定了控制標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)抑菌效力檢查法做了很大調(diào)整?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要著眼于眼用制劑抑菌劑抑菌效力的檢查[8-9]，其他劑型抑菌效力檢測(cè)方法的探討目前較少[10]。本研究中依據(jù)藥典方法對(duì)3種中藥口服液體制劑進(jìn)行了加菌試驗(yàn)，比較試驗(yàn)菌在樣品中的存活率，以探討樣品的抑菌效力，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)研發(fā)階段抑菌濃度的確定有一定參考價(jià)值[11]。