【摘 要】目的：探討黃芪多糖（簡(jiǎn)稱(chēng)APS）對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響。方法：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)研究APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響，而APS在K562細(xì)胞之中對(duì)Caspase-3產(chǎn)生的影響可通過(guò)Caspase-3活性測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè);經(jīng)Western blot以及RT-PCR對(duì)對(duì)照組（K562細(xì)胞）及APS組（通過(guò)200mg/L的APS進(jìn)行48h誘導(dǎo)形成的K562細(xì)胞）之中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果：APS組細(xì)胞凋亡數(shù)量相較于對(duì)照組更高，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;APS組K562細(xì)胞中的Caspase-3相較于對(duì)照組明顯增加，但I(xiàn)AP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá)都顯示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達(dá)無(wú)顯性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。結(jié)論：APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡可能是通過(guò)對(duì)Smac、Bax上調(diào)以及對(duì)IAP-1、Bcl-2下調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】黃芪多糖;人紅白血病;K562細(xì)胞;凋亡

白血病是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，此癥使人類(lèi)健康受到嚴(yán)重的威脅，白血病細(xì)胞在生長(zhǎng)的過(guò)程中具有凋亡受阻、增殖失控以及分化障礙等特點(diǎn)[1]。而APS屬于黃芪的活性成分之一，其具有抗應(yīng)激、降血壓、降血糖、強(qiáng)心以及抗病毒等功效，相關(guān)研究表明[2]APS能夠有效抑制多種惡性腫瘤，為了研究APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡的影響，本次研究通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)APS組和對(duì)照組中的Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白進(jìn)行表達(dá)，目的旨在研究APS對(duì)白血病治療的依據(jù)，現(xiàn)做如下報(bào)道。

1 一般資料以及主要方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)

K562細(xì)胞主要來(lái)源于本地細(xì)胞庫(kù)，通過(guò)使用10%（體積分?jǐn)?shù)）的胎牛血清（簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）、100mg/L鏈霉素以及100U/mL青霉素所形成的RPMI培養(yǎng)基參與細(xì)胞培養(yǎng)，并置于5%（體積分?jǐn)?shù)）的CO2培養(yǎng)箱之中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37℃。

1.1.2 試劑

（1）FBS：杭州四季青有限公司生產(chǎn);

（2）Trizol試劑、RPMI培養(yǎng)基以及100bp DNA Marker：美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn);

（3）Taq DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒、dNTPs：日本TAKARA公司生產(chǎn);

（4）Annexin V-FITC/PI：碧云天生物科技有限公司生產(chǎn);

（5）化學(xué)發(fā)光試劑盒：美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn);

（6）Colorimetric試劑盒、CaspACETM Assay System試劑盒：美國(guó)Promega公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

1.2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集對(duì)照組（K562細(xì)胞）及APS組（通過(guò)200mg/L的APS進(jìn)行48h誘導(dǎo)形成的K562細(xì)胞）樣本，并對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)量。通過(guò)195μL的Annexin V-FITC結(jié)合也將收集的細(xì)胞進(jìn)行重懸，然后向其中加入5μL的Annexin V-FITC，進(jìn)行10min的避光孵育，離心5min，1000r/min，去除上清。并通過(guò)190μL的Annexin V-FITC再次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸，然后向其中加入10μL的染色液（碘化丙啶），并于冰上對(duì)其進(jìn)行避光孵育，然后通過(guò)上流式細(xì)胞儀完成凋亡細(xì)胞數(shù)量的計(jì)量。實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中需要設(shè)置3個(gè)平行樣本。

1.2.2 Caspase-3活性測(cè)定

將APS組和對(duì)照組中的K562細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，并對(duì)其進(jìn)行定量。然后進(jìn)行Caspase-3活性測(cè)定，測(cè)定方法需嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)規(guī)定操作，并將相應(yīng)試劑依次加入到96孔板中使反應(yīng)混合物得以制備完成。兩組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照孔（不加蛋白）。然后向每孔加入2μL的AC-DEVA-PNA底物，避光培育，溫度設(shè)定為37℃，時(shí)間設(shè)定為4h，并對(duì)405nm位置的光密度值進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)將各組的平均值進(jìn)行計(jì)算，將各組所得平均值檢出空白對(duì)照平均值所形成的差值來(lái)對(duì)Caspase-3活性進(jìn)行表示。

1.2.3 Western blot及RT-PCR檢測(cè)

（1）Western blot檢測(cè)：將兩組K562細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，同時(shí)進(jìn)行定量，應(yīng)用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。將β-actin當(dāng)做內(nèi)參照。上樣量設(shè)定為100μg，Bcl-XL、Bcl-2、Bax、IAP-1、Smac、β-actin克隆抗體的稀釋度分別為100倍、150倍、150倍、100倍、150倍。并通過(guò)軟件對(duì)目的條帶同內(nèi)參照條帶之間的灰度比值進(jìn)行分析。

（2）RT-PCR檢測(cè)：將兩組K562細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，同時(shí)進(jìn)行定量，完成cDNA第一條鏈的體外合成，并將cDNA當(dāng)做模板來(lái)完成PCR反應(yīng)，然后使用軟件對(duì)PCR擴(kuò)增物的目的條帶同內(nèi)參照條帶之間的灰度比值進(jìn)行分析。

1.3 觀察指標(biāo)

本次研究選擇的觀察指標(biāo)為Caspase-3、Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac mRNA和蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

此次研究在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方面使用的軟件版本為SPSS20.0，以（）表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，以率（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用X2檢驗(yàn)，當(dāng)顯性差異出現(xiàn)時(shí)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響

通過(guò)檢測(cè)，APS組中K562細(xì)胞凋亡數(shù)量為（3319.00±408.64）個(gè)，相較于對(duì)照組（104.84±19.17）個(gè)更多，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，t=14.2831。

2.2 APS對(duì)Caspase-3產(chǎn)生的影響

APS組Caspase-3活性為（0.349±0.032），相較于對(duì)照組Caspase-3活性（0.092±0.011）更高，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，t=4.7436。

2.3 APS對(duì)Bcl-XL、Bcl-2、IAP-1、Bax、Smac表達(dá)產(chǎn)生影響

如表1～2，APS組K562細(xì)胞中的IAP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá)相較于對(duì)照組都顯示降低，而Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達(dá)無(wú)顯性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

3 討論

常規(guī)下細(xì)胞凋亡及增殖之間達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，可對(duì)機(jī)體穩(wěn)定性進(jìn)行維持，而凋亡和增殖一旦出現(xiàn)失衡，將可能造成腫瘤產(chǎn)生[3]。而細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控的影響較大，其中，Caspase家族便是關(guān)鍵分子，Caspase家族成員一般都具備半胱氨酸蛋白酶活性，Caspase-8以及Caspase-9在凋亡途徑中處于上游位置，而Caspase-3則屬于凋亡效應(yīng)因子，Caspase家族形成的級(jí)聯(lián)激活共同導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)[4]。

對(duì)于Caspase家族激活方面，Bcl-2家族在對(duì)其激活過(guò)程中能夠發(fā)揮調(diào)控作用，其屬于一種蛋白因子，在參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中，具體以線(xiàn)粒體這一途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控的[5]。從Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮的作用來(lái)看，其家族蛋白通常可分兩類(lèi)，分別為促進(jìn)凋亡蛋白（Bax等）和抑制凋亡蛋白（Bcl-XL、Bcl-2等），后者能夠?qū)?xì)胞出現(xiàn)的凋亡進(jìn)行抑制，從而使細(xì)胞的壽命得到延長(zhǎng)，而前者則能夠使Caspase家族得以激活，從而造成細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[6]。此外，還有研究表明[7]，Smac能夠同IAPs之間進(jìn)行結(jié)合從而使Caspase得以釋放，最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而XIAP、Livin則能夠使Smac釋放減少，從而使細(xì)胞凋亡被抑制[8]，為此，此次研究特將上述指標(biāo)加入到研究之中，以明確APS對(duì)K562細(xì)胞凋亡發(fā)揮的機(jī)制影響。

本次研究中，APS組細(xì)胞凋亡數(shù)量多于對(duì)照組，且APS組K562細(xì)胞中的Caspase-3相較于對(duì)照組明顯增加，但I(xiàn)AP-1及Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá)都顯示降低， Smac以及Bax的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增加，兩組有顯性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05;兩組在Bcl-XL的mRNA和蛋白方面的表達(dá)無(wú)顯性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。此結(jié)果能夠與上述機(jī)理對(duì)應(yīng)，說(shuō)明APS可對(duì)K562細(xì)胞凋亡產(chǎn)生重要影響。

綜上所述，APS對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡可能是通過(guò)對(duì)Smac、Bax上調(diào)以及對(duì)IAP-1、Bcl-2下調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)

[1]張海兵，辛勇，唐天友等.低劑量照射對(duì)人紅白血病細(xì)胞株 K562凋亡、Bcl-2、Bax及p53蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)刊，2015（09）：65-69.

[2]羅昊，孟贊，劉澤洪等.阿糖胞苷通過(guò)自噬途徑影響K562細(xì)胞增殖凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017（13）：14-17.

[3]孫華麗，洪其軍.X射線(xiàn)照射后Rac1蛋白對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞凋亡的影響[J].醫(yī)學(xué)信息，2014（13）：46-47.

[4]王淡瑜，劉澤林，金夢(mèng)迪等.PKF118-310對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制[J].白血病·淋巴瘤，2016，25（06）344-348.

[5]魏萬(wàn)敏.大蒜素對(duì)人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].醫(yī)學(xué)美學(xué)美容旬刊，2014（07）：141-141.

[6]張帥帥，鮮敬榮，鄒琴等.敲低TRAF6對(duì)白血病K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015（12）：1659-1665.

[7]封蔚瑩，周煬，劉忠民.高三尖杉酯堿聯(lián)合survivin抑制劑YM155對(duì)人白血病K562細(xì)胞系增殖和凋亡的影響[J].臨床血液學(xué)雜志，2015（02）：209-211.

[8]廖瓊，孫玉梅，姜夏薇等.DBO對(duì)人慢性髓系白血病細(xì)胞K562增殖和凋亡以及自噬影響[J].中華腫瘤防治雜志，2017（19）：1342-1348.

作者簡(jiǎn)介

趙淑敏（1990-），女 ，山東省菏澤市人。住院醫(yī)師。研究方向?yàn)檠簝?nèi)科。