陳麗玲, 鐘友寶, 劉 漩, 陳 來(lái), 袁可望, 黃麗婷, 李?yuàn)檴?/p>

(江西中醫(yī)藥大學(xué), 南昌 330004)

從動(dòng)物模型與臨床實(shí)際腫瘤的相近性而言, 現(xiàn)有腫瘤動(dòng)物模型中, 人腫瘤的異種移植模型是最具有應(yīng)用價(jià)值和前景的。而現(xiàn)有成熟的以免疫缺陷動(dòng)物作為載體的人源腫瘤模型存在短板： 無(wú)胸腺裸小鼠的T細(xì)胞生成障礙導(dǎo)致其無(wú)法用于移植腫瘤與特異性免疫系統(tǒng)相互作用的研究[1,2]。因此, 建立既能保留人源腫瘤生物學(xué)特性, 又具有正常免疫功能的動(dòng)物模型是腫瘤研究, 尤其是腫瘤免疫研究急需解決的問(wèn)題。我們擬利用“獲得性免疫耐受”的機(jī)制, 即“在胚胎時(shí)期, 體內(nèi)已有的針對(duì)多種抗原具有免疫活性的淋巴細(xì)胞克隆, 若與某種抗原(包括自身的或人工導(dǎo)入的) 相遇, 與其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞克隆即被破壞或抑制,出生后只對(duì)胚胎期曾接觸過(guò)的抗原形成耐受, 而對(duì)胚胎時(shí)期從未接觸過(guò)的抗原仍有免疫應(yīng)答[3]”, 在具有完善免疫系統(tǒng)的KM小鼠基礎(chǔ)上, 建立適用于人來(lái)源的、且免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型, 以達(dá)到為腫瘤研究, 尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型的目的。在模型建立初期, 我們擬向孕鼠子宮內(nèi)的胎鼠注射人肝癌HepG2細(xì)胞, 之后在成功出生且存活的胎鼠肝臟原位移植人肝癌HepG2細(xì)胞, 評(píng)價(jià)成瘤效果, 并考察荷瘤小鼠的免疫功能和對(duì)HepG2細(xì)胞及其他人腫瘤瘤株的排斥情況。在考察小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞殺傷作用的過(guò)程中, 計(jì)劃?rùn)z測(cè)樣本量較大, 因此需要建立一種操作方便、快速的檢測(cè)方法。目前經(jīng)常使用的細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)方法中, 經(jīng)典的51Cr釋放法存在自然釋放率較高、放射性會(huì)對(duì)細(xì)胞及操作人員造成傷害等不足; 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法因影響因素較多和背景信號(hào)的干擾等問(wèn)題, 應(yīng)用有限[4]; 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(Enzyme-linked immunospot, ELISPOT)檢測(cè)技術(shù)、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex, MHC)四聚體顯示T細(xì)胞受體的染色技術(shù)和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色等技術(shù), 只能通過(guò)間接檢測(cè)T細(xì)胞表面受體或細(xì)胞因子的水平反應(yīng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL)活性[5]。

羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)是一種本身不發(fā)熒光的活體染料，它可穿透細(xì)胞膜，被胞內(nèi)酯酶轉(zhuǎn)化成具有綠色熒光的氨基反應(yīng)性羧基熒光素琥珀酰亞胺酯，同時(shí)失去自由透過(guò)細(xì)胞的能力，可穩(wěn)定標(biāo)示活細(xì)胞[6-8]。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑, 其不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。在效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞混合前，先將靶細(xì)胞用CFSE染色, 染色后的靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞混合作用后，再用PI染色，采用流式細(xì)胞術(shù)即可區(qū)分被殺傷靶細(xì)胞及存活靶細(xì)胞，并體現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞的死亡情況，測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性, 且檢測(cè)速度較快。

本實(shí)驗(yàn)擬建立基于流式細(xì)胞術(shù)的評(píng)價(jià)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞殺傷活性的方法，以準(zhǔn)確檢測(cè)模型小鼠脾細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2013-0004]。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心[SYXK(贛)2017-0004]。實(shí)驗(yàn)獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審查證號(hào)：JZLLSC207-0021)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心惠贈(zèng)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.3 藥品及主要試劑

CFSE(批號(hào)為S8269)購(gòu)自美國(guó)Selleck生物科技有限公司; PI(批號(hào)為2018/12)購(gòu)自合肥新恩源生物技術(shù)有限公司; 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(批號(hào)為20171108)、DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)(批號(hào)為20170812)和胎牛血清(批號(hào)為RY3201)均購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司; 紅細(xì)胞裂解液(批號(hào)為20170731)、胰蛋白酶(批號(hào)為T1300)和臺(tái)盼藍(lán)染液(批號(hào)為： 20161122)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)為C150)購(gòu)自德國(guó)賓德有限責(zé)任公司，流式細(xì)胞儀(型號(hào)為FACSVerse)購(gòu)自美國(guó)BD醫(yī)療器械有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 靶細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，移入CO2培養(yǎng)箱，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.5.2 效應(yīng)細(xì)胞小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 摘眼球取血后，將小鼠浸泡在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中3 min，移至超凈臺(tái)中無(wú)菌取脾臟，開(kāi)左側(cè)腹部皮膚，分離皮下組織和肌肉，暴露并小心分離脾臟, 放入預(yù)冷PBS中。將脾臟置于200目不銹鋼網(wǎng)上，用注射器內(nèi)芯頭研磨成單細(xì)胞，收集后1 000 r/min離心5 min, 棄上清, 加入3倍量紅細(xì)胞裂解液, 4 ℃靜置15 min, 其間輕輕渦旋混勻2次, 1 000 r/min離心10min, 棄上清, 預(yù)冷PBS沖洗, 含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液至不同濃度備用[18]。

1.5.3 靶細(xì)胞人肝癌HepG2細(xì)胞的標(biāo)記

1.5.3 .1 CFSE及PI 對(duì)靶細(xì)胞的區(qū)分效果 6孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%，用5 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min, PBS洗1次, 加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基及無(wú)水乙醇,使無(wú)水乙醇的終濃度分別為0.4 mol/L、0.8 mol/L、1.6 mol/L[9], 培養(yǎng)6 h后, 收集細(xì)胞, PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.3 .2 CFSE標(biāo)記對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性 24孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%，分別以2.5 μmol/mL、5.0 μmol/mL、10 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min，每隔1 h收集細(xì)胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率，至第18 h結(jié)束。未經(jīng)CFSE標(biāo)記的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5.3 .3 CFSE標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析 24孔板接種HepG2細(xì)胞, 貼壁, 至匯合度約為80%, 分別以2.5 μmol/mL、5.0 μmol/mL、10 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min，每隔1 h收集細(xì)胞，PBS沖洗，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值(Median fluorescent intensity，MFI)，至18 h結(jié)束。

1.5.4 CFSE及PI對(duì)效靶細(xì)胞的區(qū)分效果 24孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%，此時(shí)HepG2細(xì)胞數(shù)約為4×105/孔。以2.5 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min，PBS洗1次，加入1 mL濃度為4×106/mL的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以效靶比10∶1作用6 h，收集細(xì)胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5.5 效靶作用時(shí)間及效靶比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響24孔板接種HepG2細(xì)胞，貼壁，至匯合度約為80%，此時(shí)HepG2細(xì)胞數(shù)約為4×105/孔。以2.5 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min，PBS洗1次，分別加入1mL濃度為2×106/mL、4×106/mL、8×106/mL、1.6×107/mL、3.2×107/mL、4×107/mL的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，以效靶比5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1、100∶1分別作用6 h、12 h和18 h，收集細(xì)胞，PBS沖洗，加入PI至終濃度為12.5 μg/mL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的存活率，并按下式計(jì)算殺傷率。

殺傷率(%)=(陰性對(duì)照靶細(xì)胞存活率-試驗(yàn)組靶細(xì)胞存活率)/陰性對(duì)照靶細(xì)胞存活率×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CFSE標(biāo)記對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的作用

2.1.1 CFSE 及PI 對(duì)靶細(xì)胞的區(qū)分效果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明, 采用CFSE/PI 雙標(biāo)記能有效分離各組群： CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-,其中CFSE+PI-為未被乙醇?xì)陌屑?xì)胞，CFSE+PI+為被乙醇?xì)陌屑?xì)胞，CFSE-PI+為CFSE標(biāo)記前死亡的效應(yīng)細(xì)胞。隨著無(wú)水乙醇的濃度逐漸增加，CFSE+PI+細(xì)胞，即被乙醇?xì)陌屑?xì)胞的比例逐漸增加(圖1)。

2.1.2 CFSE 標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞的毒性 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，1～18 h，各濃度CFSE標(biāo)記的人肝癌HepG2細(xì)胞的存活率無(wú)明顯下降，表明在18 h以內(nèi)，CFSE對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的存活無(wú)明顯影響(圖2)。

2.1.3 CFSE 標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，1～18h，隨著時(shí)間的推移，各濃度CFSE標(biāo)記的人肝癌HepG2細(xì)胞的MFI值均逐漸下降, 6 h后趨于穩(wěn)定，12 h后又有較小范圍波動(dòng)。在6～12 h，以2.5μmol/mL和5.0 μmol/mL的CFSE標(biāo)記后的MFI值更為穩(wěn)定(圖3)，表明后續(xù)測(cè)定細(xì)胞殺傷活性時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的作用時(shí)間以6～12 h為宜。

圖1 CFSE 及PI 對(duì)靶細(xì)胞區(qū)分效果Figure 1 The differentiating effect of CFSE and PI on target cells

圖2 CFSE對(duì)人HepG2細(xì)胞的毒性Figure 2 The cytotoxicity of CFSE to human HepG2 cells

2.2 CFSE 及PI 對(duì)效靶細(xì)胞的區(qū)分效果

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，采用CFSE/PI 雙標(biāo)記能有效分離殺傷實(shí)驗(yàn)所需各組群：CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-，其中 CFSE+PI-為未被殺傷的靶細(xì)胞，CFSE+PI+為被殺傷的靶細(xì)胞，CFSE-PI+為效靶相互作用過(guò)程中死亡的效應(yīng)細(xì)胞和CFSE標(biāo)記前死亡的效應(yīng)細(xì)胞，CFSE-PI-為效靶相互作用過(guò)程中存活的效應(yīng)細(xì)胞(圖4)。

2.3 效靶作用時(shí)間及效靶比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，效靶比在5∶1至40∶1時(shí)，效靶作用時(shí)間為12 h的細(xì)胞殺傷率較18 h及6 h高; 效靶比在40∶1以上時(shí)，則殺傷率隨效靶作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。其中效靶比為10∶1時(shí)，效靶作用時(shí)間為12 h與作用時(shí)間為6 h的殺傷率相比有極顯著性差異(P＜0.01)，效靶比為100∶1時(shí)，效靶作用時(shí)間為12 h與作用時(shí)間為6 h的殺傷率相比有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

效靶作用時(shí)間相同時(shí)，細(xì)胞殺傷率總體隨效靶比的增加而增加，但效靶比在10∶1至80∶1間無(wú)顯著性差異，直至效靶比上升至100∶1時(shí)，殺傷率才有明顯增加： 效靶作用時(shí)間為12 h時(shí)，效靶比100∶1與10∶1相比有顯著性差異(P＜0.05)，效靶作用時(shí)間為6h時(shí)，效靶比100∶1與10∶1相比有極顯著性差異(P＜0.01)(表1)。

圖3 CFSE對(duì)人HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線Figure 3 The time dynamics of fluorescent density of CFSE-labeled human HepG2 cells

圖4 CFSE 及PI 對(duì)效靶細(xì)胞區(qū)分效果Figure 4 The differentiating effect of CFSE and PI on effector cells and target cells

表1 效靶作用時(shí)間及效靶比對(duì)細(xì)胞殺傷率的影響Table 1 The effect of action time between effector and target cells and the effector to target cell ratios on the specific cellular killing activity %

3 討論

在建立既能保留人體腫瘤生物學(xué)特性，且免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型的過(guò)程中，我們需要找到一種方便操作的檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞對(duì)人腫瘤細(xì)胞殺傷作用的方法以應(yīng)對(duì)較大的檢測(cè)需求[10]。經(jīng)典的51Cr釋放法、LDH釋放法、ELISPOT技術(shù)和MHC四聚體染色等技術(shù)由于各種原因，不能完全滿足本實(shí)驗(yàn)對(duì)殺傷作用檢測(cè)的要求。

流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種高速單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)，能對(duì)檢測(cè)的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用適當(dāng)?shù)牟煌瑹晒馊玖希纯捎行^(qū)分多種細(xì)胞及其存活狀態(tài)，而流式細(xì)胞術(shù)這種基于單細(xì)胞水平上的檢測(cè)手段也保證了多種細(xì)胞共檢測(cè)時(shí)各種細(xì)胞間數(shù)量差距較大時(shí)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

本文對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞對(duì)人HepG2細(xì)胞殺傷活性的方法進(jìn)行了初步的標(biāo)準(zhǔn)化探討：CFSE和PI雙染可有效區(qū)分各細(xì)胞群，實(shí)驗(yàn)中采用的各濃度CFSE對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞未見(jiàn)明顯毒性。CFSE 標(biāo)記人肝癌HepG2細(xì)胞熒光強(qiáng)度的時(shí)間動(dòng)力學(xué)分析表明，2.5 μmol/mL和5.0 μmol/mL的CFSE標(biāo)記的MFI值在6～12 h更為穩(wěn)定, 且效靶作用時(shí)間為12 h的殺傷率較6 h高, 所以確定效靶作用時(shí)間為12 h。在對(duì)效靶比的考察中，結(jié)果表明10∶1和100∶1為適宜效靶比, 但考慮在模型建立過(guò)程中, 需對(duì)新生小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行特異殺傷活性檢測(cè), 可能存在采集的脾細(xì)胞數(shù)量較少的情況, 故確定效靶比為10∶1。最終確定的實(shí)驗(yàn)方法為： 24孔板接種HepG2細(xì)胞, 貼壁, 至細(xì)胞匯合度約80%時(shí), 以2.5 μmol/mL的CFSE標(biāo)記10 min, PBS洗1次, 加入含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整濃度的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液, 以效靶比10∶1相互作用12 h, 收集細(xì)胞, PBS沖洗, 加入PI至終濃度為12.5 μg/mL,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的存活率, 并計(jì)算殺傷率。

本方法可有效、精確評(píng)價(jià)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的殺傷作用，為后續(xù)模型的建立打下了基礎(chǔ)。