劉 波, 王 楊, 李志杰

(1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心, 沈陽(yáng) 110004;2. 遼寧省環(huán)境與代謝疾病動(dòng)物模型研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽(yáng) 110004;3. 遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科, 沈陽(yáng) 110042)

八臂迷宮是一種研究動(dòng)物空間記憶的迷宮模型，主要用于不同藥物處理以及疾病模型下動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶、覓食策略、空間認(rèn)知等多方面的研究[1]。它由八邊形中央?yún)^(qū)和與其連接的八條工作臂組成。實(shí)驗(yàn)者通過在特定食餌臂末端放入食餌作為對(duì)進(jìn)入該臂的獎(jiǎng)賞，而在其余臂內(nèi)不放食餌或通過刺激手段懲罰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的方式對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行迷宮覓食訓(xùn)練。動(dòng)物在饑餓驅(qū)使下探索迷宮尋找食餌，通過一定時(shí)間的訓(xùn)練后，可對(duì)迷宮各臂進(jìn)行自由探索并成功躲避沒有食餌的工作臂完成覓食。通過水，電等刺激-應(yīng)答模塊建立完整的條件、非條件環(huán)境刺激，配合視頻采集系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物覓食或逃避策略，提供靈敏且易于操作的技術(shù)以分析不同藥物處理或疾病模型損傷對(duì)記憶相關(guān)腦區(qū)的影響，用于評(píng)估發(fā)育神經(jīng)損傷處理對(duì)嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知的影響[2]。

目前大多文獻(xiàn)采用的傳統(tǒng)八臂迷宮實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)際操作中的訓(xùn)練周期長(zhǎng)達(dá)2～4周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成功躲避無(wú)誘餌臂端快速找到食餌臂端概率較低，且單次探索時(shí)間長(zhǎng)或是訓(xùn)練次數(shù)過多，不能在短時(shí)間合理訓(xùn)練頻率下有效評(píng)估空間學(xué)習(xí)記憶能力，無(wú)法方便服務(wù)于實(shí)驗(yàn)者快速有效完成實(shí)驗(yàn)[2]。為此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良電加熱條件刺激八臂迷宮裝置探索新型八臂迷宮實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(200±10)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供[SCXK(遼)2015-0001], 隨機(jī)分為2組, 對(duì)照組10只按照傳統(tǒng)八臂迷宮方法進(jìn)行訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)組10只按照改良方法進(jìn)行訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)開始前一周所有大鼠開始控制攝食量，每日定時(shí)投喂飼料10 g/只，控制體質(zhì)量保持在原體質(zhì)量的80%～85%，飲水不限[SYXK(遼)2017-0004]。并于固定時(shí)間對(duì)將要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的大鼠實(shí)施撫摸安撫以適應(yīng)環(huán)境，并于實(shí)驗(yàn)開始前禁食12h。

1.2 儀器設(shè)備

視頻追蹤系統(tǒng)： Ethovision XT 小動(dòng)物視頻軌跡行為學(xué)分析系統(tǒng)，購(gòu)自荷蘭Noldus公司; 箱體： 標(biāo)準(zhǔn)大鼠八臂迷宮箱體，尺寸為單臂長(zhǎng)425 mm，寬145 mm，高225 mm，購(gòu)自北京眾實(shí)科技有限公司; 獎(jiǎng)勵(lì)食餌： 經(jīng)60Co輻照滅菌的市售生瓜子仁; 懲罰裝置： 4個(gè)電輔熱裝置，尺寸100 mm×100 mm，購(gòu)自江蘇省東臺(tái)市正龍電熱電器廠; 參考物： 各臂內(nèi)貼不同形狀參考物(以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物對(duì)周圍環(huán)境的記憶)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

第1日：讓大鼠適應(yīng)迷宮環(huán)境。將禁食12 h的2組大鼠隨機(jī)各再分為5組，每組2只。將迷宮閘門同時(shí)打開并在各臂末端及中央?yún)^(qū)域各投放5個(gè)瓜子仁作為食餌，2只大鼠同時(shí)放入迷宮中央?yún)^(qū)域, 讓其自由攝食、探究10 min，每日訓(xùn)練2次。以大鼠后肢完全進(jìn)入臂門記為進(jìn)入該臂1次。

第2日：重復(fù)第1日的訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)人員于訓(xùn)練開始前輕柔安撫動(dòng)物5～10 min，使其放松地自由探索迷宮環(huán)境。

第3日：迷宮及食餌位置保持不變，每只大鼠單獨(dú)進(jìn)入迷宮訓(xùn)練，使其大膽?yīng)氉蕴剿髅詫m環(huán)境。每只鼠在單次訓(xùn)練結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%酒精噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。

第4日：為對(duì)照組大鼠設(shè)定特定食餌臂以及空食餌臂，例如1號(hào)動(dòng)物食餌臂1，3，5，6; 空食餌臂為2，4，7，8。實(shí)驗(yàn)組大鼠設(shè)定固定食餌臂及電加熱懲罰臂，例如： 1號(hào)動(dòng)物食餌臂為2，4，5，8; 電加熱懲罰臂為1，3，6，7。在每個(gè)食餌臂投放1顆瓜子仁作為食餌。電加熱懲罰裝置溫度設(shè)定為60 ℃。電加熱懲罰臂末只放置電加熱裝置而不放食餌。實(shí)驗(yàn)者將大鼠輕柔地放入至八臂迷宮中央，適應(yīng)環(huán)境30 s后同時(shí)打開閘門讓其自由探究直至吃完食餌或總探索時(shí)間達(dá)10 min結(jié)束訓(xùn)練，每日訓(xùn)練2次。

第5至第7日；重復(fù)第4日的訓(xùn)練。

第8日：連接視頻軌跡跟蹤采集系統(tǒng)，設(shè)定大鼠編號(hào)及采集信息，只在對(duì)應(yīng)編號(hào)的食餌臂放置1顆瓜子仁作為食餌，而在其他臂中不做任何處理。每只鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇噴灑擦拭箱體以去除氣味滯留。實(shí)驗(yàn)者輕柔地將大鼠放置于迷宮中央，適應(yīng)環(huán)境30 s后同時(shí)打開閘門并開始記錄其自由探究運(yùn)動(dòng)軌跡。軟件分析2組大鼠移動(dòng)距離、移動(dòng)速度、總體耗時(shí)、參考記憶錯(cuò)誤以及工作記憶錯(cuò)誤等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，以評(píng)估兩種方法對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶探索能力。工作記憶錯(cuò)誤(working memory errors)，即在同一次實(shí)驗(yàn)中大鼠再次進(jìn)入已經(jīng)吃過食餌的臂; 參考記憶錯(cuò)誤(reference memory errors), 即在一次實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物進(jìn)入非食餌臂。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 平均移動(dòng)距離、探索時(shí)間和移動(dòng)速度

分析第8日采集的視頻軌跡可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組完成實(shí)驗(yàn)的平均移動(dòng)距離和平均探索時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而平均移動(dòng)速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)，表明本實(shí)驗(yàn)中使用的加熱裝置不會(huì)對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力造成影響。

2.2 參考記憶錯(cuò)誤和工作記憶錯(cuò)誤百分比

分析2組大鼠第8日采集視頻軌跡可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組完成實(shí)驗(yàn)的參考記憶錯(cuò)誤百分比存在極顯著差異(P＜0.01)且小于15%達(dá)到訓(xùn)練標(biāo)準(zhǔn)。而工作記憶錯(cuò)誤百分比無(wú)顯著差異(P＞0.05)(表2)。

2.3 第7日訓(xùn)練結(jié)果

在訓(xùn)練第7日，2組大鼠均能在10 min內(nèi)成功完成探索任務(wù)。但對(duì)照組大鼠完成探索所需時(shí)間明顯長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)組。

表1 平均移動(dòng)距離、探索時(shí)間和移動(dòng)速度

表2 探索過程的參考記憶錯(cuò)誤和工作記憶錯(cuò)誤百分比

2.4 運(yùn)動(dòng)軌跡圖

通過視頻軌跡跟蹤系統(tǒng)軌跡(圖1)可見，對(duì)照組大鼠在傳統(tǒng)方式訓(xùn)練7 d后無(wú)法達(dá)到八臂迷宮實(shí)驗(yàn)追蹤測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠在改良實(shí)驗(yàn)方法訓(xùn)練7日后均達(dá)到八臂迷宮實(shí)驗(yàn)追蹤測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡圖

3 討論

八臂迷宮又稱放射性迷宮，該裝置已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)藥物作用或疾病模型損傷下嚙齒類動(dòng)物大腦空間學(xué)習(xí)記憶能力[3]。八臂迷宮實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確敏感地反映腦空間學(xué)習(xí)記憶功能，使其成為檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物空間記憶的重要實(shí)驗(yàn)方法之一?？臻g記憶又分為參考記憶和工作記憶。工作記憶屬于程序性記憶范疇，是在皮層-紋狀體系統(tǒng)調(diào)控下完成的對(duì)進(jìn)行中工作任務(wù)的重要信息的短期存儲(chǔ)；參考記憶則是空間定位物體本身以及物體與食餌的相對(duì)關(guān)系[4]。海馬結(jié)構(gòu)在短期記憶向長(zhǎng)期記憶轉(zhuǎn)變和空間學(xué)習(xí)記憶功能中發(fā)揮至關(guān)重要作用[5]。

實(shí)驗(yàn)者可通過分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡參數(shù)，客觀反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在不同處理?xiàng)l件下特定腦區(qū)空間分離記憶能力[6]。然而參考國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)[2,3,11]表明，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)操作目前沒有標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的工作流程。想要達(dá)到最終追蹤測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)即工作記憶錯(cuò)誤和參考記憶錯(cuò)誤均小于15%，通常需要2～4周甚至更長(zhǎng)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組大鼠在訓(xùn)練7d后雖然能在10 min內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)探索，但參考記憶錯(cuò)誤(平均值41.56%)遠(yuǎn)超15%的要求。證明傳統(tǒng)訓(xùn)練方式無(wú)法在7 d內(nèi)使大鼠達(dá)到最終測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)。所以非常需要有針對(duì)大鼠行為特點(diǎn)的新型訓(xùn)練設(shè)備和相對(duì)規(guī)范的操作流程。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性采用在無(wú)食餌臂增加電加熱設(shè)備刺激大鼠足底的改良八臂迷宮實(shí)驗(yàn)方案。并且通過實(shí)驗(yàn)證明相對(duì)于傳統(tǒng)方法，此方案能在連續(xù)7 d的訓(xùn)練過程中使大鼠在八臂迷宮中快速準(zhǔn)確完成覓食活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比中表明，兩組大鼠均能對(duì)陌生的八臂迷宮環(huán)境進(jìn)行自主探索覓食。在分析覓食策略中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用改良實(shí)驗(yàn)方法在相同訓(xùn)練時(shí)間內(nèi)能顯著縮短覓食運(yùn)動(dòng)平均移動(dòng)距離和探索時(shí)間, 更好體現(xiàn)動(dòng)物進(jìn)化中優(yōu)先選擇食餌策略。分析兩組大鼠平均運(yùn)動(dòng)速度可知，改良實(shí)驗(yàn)中60 ℃的足底熱刺激對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力無(wú)明顯影響。證明相對(duì)于其他水、光、電強(qiáng)刺激, 合理溫度的熱刺激更能降低受試動(dòng)物的應(yīng)激概率，以免出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因過于恐懼停止探索或強(qiáng)刺激作用下的恐懼情緒對(duì)空間記憶形成影響等所致實(shí)驗(yàn)失敗現(xiàn)象[2]。除此之外，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠參考記憶錯(cuò)誤百分比有極顯著降低，證明改良實(shí)驗(yàn)方法有利于增強(qiáng)大鼠對(duì)食餌臂和非食餌臂空間記憶。有趣的是, 兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果中工作記憶錯(cuò)誤百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示改良實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短時(shí)記憶無(wú)顯著影響, 再次表明此方案中的熱刺激條件不會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用改良電加熱八臂迷宮設(shè)備配合參考諸多國(guó)內(nèi)外權(quán)威文獻(xiàn)及多次實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)，形成的實(shí)驗(yàn)操作流程能在訓(xùn)練7 d后完成檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的八臂迷宮實(shí)驗(yàn)。相比于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法，改良迷宮設(shè)備造價(jià)低廉，價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯，且操作流程簡(jiǎn)單易學(xué)，并能顯著縮短迷宮訓(xùn)練周期，為更好評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物空間分離記憶功能檢測(cè)提供新方案。