錢恩芳 ，鄧盼 ，黃美莎 ，馬泉 ，趙慧 ，李彩霞 ，黃江 ，江麗

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；3.株洲市公安局，湖南 株洲 412007；4.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001）

Y染色體為男性特有的性染色體，約95%區(qū)域?yàn)榉侵亟M區(qū)，呈父系遺傳[1]。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）為二等位基因遺傳標(biāo)記，突變率較短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）序列低，回復(fù)突變和二次突變少，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。Y染色體SNP（Y-SNP）在族群地理中的分布具有特異性，在不同族群和不同地區(qū)范圍內(nèi)具有特有的譜系分布，是研究人類父系遷移及進(jìn)化的理想遺傳標(biāo)記[2-4]。Y染色體D-M174單倍群是從非洲的YAP+位點(diǎn)分化出來的，主要分布在安達(dá)曼島、中國西藏和日本[5-8]。目前法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的祖先信息遺傳標(biāo)記大多位于常染色體上，可區(qū)分的族群為3～10個(gè)，在東亞族群及混合族群中分辨力不足[9-14]。Y染色體單倍群的族群地理特異性可為男性生物樣本的族群地理來源推測提供更多生物信息[15-16]。本研究觀察了Y染色體D-M174單倍群及下游分支D1-CTS11577、D1a-F6251、D1a1-M15、D1a2-P99、D1b-M64.1 和 D2-L1378共7個(gè)Y染色體單倍群在東亞22個(gè)族群中的遺傳分布特點(diǎn)，同時(shí)對共享單倍群內(nèi)個(gè)體的Y染色體STR（Y-STR）進(jìn)行檢測和分析。本研究將進(jìn)一步揭示Y染色體D單倍群及其下游分支在東亞人群中的分布特征，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及群體遺傳學(xué)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

本研究的群體樣本包括22個(gè)東亞族群、1個(gè)歐洲族群、1個(gè)非洲族群，共1426例無關(guān)男性個(gè)體（表1）。所有樣本對象均簽署知情同意書。本研究已通過公安部物證鑒定中心倫理委員會的審查批準(zhǔn)。

1～20號群體樣本為靜脈血，DNA提取采用QIAamp?DNA Blood Mini試劑盒（德國Qiagen公司）。21～24號群體樣本為細(xì)胞系，提取后DNA使用NanoDrop 2000c分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司）進(jìn)行定量。

表1 24個(gè)群體樣本信息

1.2 分型方法

1.2.1 Y-SNP遺傳標(biāo)記

選取的位點(diǎn)為2017版Y染色體譜系樹（YCC：https://isogg.org/）上主要D單倍群及主要的下游分支，包括M174、CTS11577、F6251、M15、M64.1、P99、L1378。7個(gè)Y-SNP單倍群構(gòu)成的譜系樹見圖1。PCR擴(kuò)增引物和延伸引物用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 D-M174單倍群譜系樹

采用Applied BiosystemsTMSNaPshotTMMultiplex試劑盒（美國AB公司）對樣本在7個(gè)Y-SNP位點(diǎn)上的分型進(jìn)行檢測，檢測方法見文獻(xiàn)[17]。使用Mastercycler?Pro梯度PCR擴(kuò)增儀（德國Eppendorf公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用3130xl基因分析儀（美國AB公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。利用GeneMapperIDv3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）分析分型結(jié)果。

1.2.2 Y-STR遺傳標(biāo)記

采用DNATyperTMY26 PCR試劑盒[18]（公安部物證鑒定中心）檢測樣本在22個(gè)Y-STR基因座（DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS444、DYS447、DYS448、DYS456、DYS458、DYS460、DYS508、DYS522、DYS533、DYS617、DYS635和GATA-H4）上的分型。使用Mastercycler?Pro梯度PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用3130xl基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。利用GeneMapperIDv3.2軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司）分析分型結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于圖1譜系樹，根據(jù)各樣本在7個(gè)Y-SNP位點(diǎn)上的分型判斷其所屬單倍群類別，用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)各單倍群頻率。根據(jù)單倍群頻率分布，使用R v3.2.3軟件繪制熱圖，進(jìn)行聚類分析。根據(jù)22個(gè)Y-STR基因座的等位基因頻率，使用PHYLIP v3.65構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對共享Y-SNP單倍群的個(gè)體，使用Network v5.022軟件（英國Fluxus Technology公司）繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 D單倍群在族群間的分布

根據(jù)國際Y染色體協(xié)會的命名法則，7個(gè)Y-SNP位點(diǎn)共組成7種單倍群（圖1）。在24個(gè)族群中共檢測出5種單倍群，未見D1*和D2單倍群的分布（圖2）。在非洲黑人和歐洲白人中未發(fā)現(xiàn)D*及其下游單倍群的分布。在東亞族群中，單倍群D-M174在西藏藏族人中的頻率達(dá)到40.96%，在日本人中的頻率為35.71%，在四川西昌彝族人中有17.86%的分布，青海土族人中有11.86%的分布，而在余下的群體中分布頻率更低（均低于8%）。D單倍群的下游分支在東亞不同族群中的分布頻率有明顯差異。單倍群D1a1-M15散布于以藏族（10.26%）為主的東亞族群中。單倍群D1a2-P99在藏族中檢測頻率最高（26.92%），而在其他群體中零星分布。除了在藏族中檢測到1例，單倍群D1b-M64.1只分布在日本（28.57%）。

圖2 24個(gè)群體Y-SNP單倍群分布熱圖

從圖2左側(cè)的系譜樹可以看出：西藏藏族人和日本人在D單倍群上高頻分布而聚為一支，但是西藏藏族人在D1a2單倍群上高頻分布，日本人在D1b單倍群上高頻分布，因而各自聚為一小類支；青海裕固族人、廣西京族人、青海土族人、四川西昌彝族人在D單倍群上有較高頻率分布而聚為一類支；廣西侗族人、河南漢族人、新疆回族人、新疆維吾爾人、青海撒拉族人、新疆哈薩克族人、非洲黑人、韓國人、青海回族人、歐洲白人、廣西壯族人、廣西瑤族人、云南佤族人、新疆塔吉克族人、廣西苗族人、五峰漢族人、廣西漢族人、青海漢族人在D單倍群上低頻分布或無分布而聚為一大類支。

2.2 族群系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

基于24個(gè)族群在22個(gè)Y-STR基因座上的等位基因頻率構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），以非洲黑人為進(jìn)化樹的根節(jié)點(diǎn)，24個(gè)族群主要分為兩類：一類為新疆塔吉克族人、歐洲白人、新疆維吾爾族人、青海撒拉族人、新疆回族人；另一類為余下18個(gè)族群聚為一大類，其中西藏藏族人和四川西昌彝族人聚為一小類，日本人和韓國人聚為一小類。

圖3 24個(gè)族群系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 D單倍群分支遺傳關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分析

應(yīng)用鄰接法對Y染色體單倍群D1-CTS11577、D1a-F6251、D1a1-M15、D1a2-P99、D1b-M64.1分別繪制網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），進(jìn)一步分析D單倍群在東亞族群的遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示，在D1-CTS11577單倍群下，西藏藏族人相對緊密聚類位于網(wǎng)絡(luò)圖的中心，日本人緊密聚為一大類。其他有D單倍群的族群散在分布于藏族族群周邊位置。在下游分支單倍群中，D1a2-P99單倍群西藏藏族人分布最多，D1b-M64.1單倍群基本上是日本人分布，僅有1例是西藏藏族人。D1a1單倍群則是各個(gè)不同族群所共享的單倍群，西藏藏族人和四川彝族人頻率較高，分別為10.26%和12.5%，其他民族頻率較低（＜7%）。

圖4 Y染色體單倍群D1-CTS11577、D1a-F6251、D1a1-M15、D1a2-P99、D1b-M64.1的Y-STR網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

單倍群D是從非洲YAP插入單倍群衍生出來的[19]，在全球的分布具有明顯的地域特異性。D-M174單倍群高頻分布于東亞，主要分布于西藏藏族人和日本人（30%～40%），在東亞其他族群、東亞周邊（中亞、北亞、中東）族群等罕見，分布頻率通常低于5%[20]。

本研究中D單倍群在藏族和日本高頻分布，分別為40.96%和35.71%。在東亞其他族群中有低頻分布或沒有分布，研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致。D單倍群的下游分支在不同族群中的分布頻率不同。D1-M15（現(xiàn)已更名為D1a1-M15）在青海藏族人、西藏藏族人、四川涼山彝族人、云南彝族人中廣泛分布，在東亞其他群體中也有低頻分布[21]。D1a1-M15廣泛分布于西藏藏族人、四川西昌彝族人、廣西京族人、青海裕固族人，低頻分布于河南漢族、青海土族、廣西侗族、新疆回族和日本族群中。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D1a2高頻分布于西藏藏族人，同時(shí)在其他東亞族群中低頻分布，印證了既往研究結(jié)果[22-23]，即D1a2-P99下游分支P47位點(diǎn)突變僅在藏緬族群中出現(xiàn)。日本人主要是M55、M57、M64等突變位點(diǎn)界定的單倍群[22]，是上古繩文人的主要成分[6]。本研究中，D1b-M64.1單倍群除了在西藏藏族人群中檢測到1例外，都分布在日本人中，頻率達(dá)到28.57%。但是，文獻(xiàn)報(bào)道[24]與M64.1平行的M57、M55、P37.1位點(diǎn)僅在日本人中檢測到，在日本人以外的地區(qū)非常罕見，這可能是樣本量少或近期基因流動所致。單倍群D1a2-P99和D1b-M64.1的分布具有較強(qiáng)的族群特異性。

Y-SNP突變率較低，遺傳穩(wěn)定性高，包含更多關(guān)于群體的歷史信息，可反映人類父系的遺傳特征，并追溯久遠(yuǎn)的歷史進(jìn)化事件，而Y-STR突變率較高，可反映起源相同群體近期基因交流。例如，西藏藏族人與日本人的D單倍群頻率的族群聚類結(jié)果（圖2）與Y-STR頻率數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果（圖3）基本一致，系統(tǒng)發(fā)育樹將亞族群進(jìn)一步細(xì)分和聚類。西藏藏族人和四川西昌彝族人的D單倍型聚類結(jié)果與YSTR系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果不一致，D單倍群聚類中西藏藏族人和四川西昌彝族人分別聚類，表明歷史上兩族群由于交通閉塞、不通婚等因素各自進(jìn)化；而在進(jìn)化樹中聚在一起，可能在人類社會發(fā)展中，族群間遷徙、通婚等動態(tài)變化過程可能會影響族群間遺傳成分。遺傳關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖聚類結(jié)果也表明，各個(gè)單倍群下游的樣本間呈現(xiàn)以同一族群小范圍內(nèi)聚集的現(xiàn)象，表明在一定范圍內(nèi)，同一族群內(nèi)的樣本間遺傳關(guān)系更為密切。遺傳關(guān)系較近的族群間，樣本分布呈現(xiàn)相互交叉的情況，表明可能在歷史上存在一定的基因交流。遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的族群間交叉的情況較少。

基于Y-SNP單倍群及其下游分支在世界人群中的地域分布特點(diǎn)，通過檢測Y染色體單倍群可推測樣本的父系族群來源。BRIóN等[16]用Y-SNP分型方法預(yù)測男性地理來源，能區(qū)分世界范圍內(nèi)主要地區(qū)的人群，認(rèn)為推斷未知樣本的種族地域來源在刑事案件調(diào)查階段具有巨大的價(jià)值。Y-SNP單倍群的下游細(xì)小分支在小范圍內(nèi)具有明顯的地域差異性，可為法庭提供科學(xué)證據(jù)[25-26]。D單倍群在東亞族群中具有明顯的族群地域分布特征，高頻分布于西藏藏族人（40.96%）和日本人（35.71%），在平原漢族中分布低（＜3%），其中26.92%藏族人主要為D1a2-P99亞單倍群，28.57%日本人主要為D1b-M64.1亞單倍群。目前，洲際人群推斷技術(shù)已非常成熟[12，14，27-28]，D 單倍群的族群特異性分布特征為進(jìn)一步細(xì)分東亞亞人群提供了新的視角，可進(jìn)一步完善法醫(yī)SNP族群地域推斷體系，為刑事案件偵查提供科學(xué)依據(jù)。值得注意的是，O單倍群在東亞族群中均占相當(dāng)一部分比例[22，29]，未來可采集更多不同地域典型族群樣本，并對該單倍群及其下游分支進(jìn)行更細(xì)分的研究。此外，Y-SNP只是從父系的遺傳上進(jìn)行族群地域的推斷，缺乏母系的遺傳信息。有學(xué)者[30]提出，將Y染色體、常染色體和線粒體進(jìn)行綜合分析，能夠獲得更加準(zhǔn)確的祖先地域推斷。下一步，我們將結(jié)合常染色體及線粒體DNA遺傳信息進(jìn)行相關(guān)研究，得到更為完善的推斷證據(jù)，該技術(shù)方法在東亞人群及混合人群的族群地域推斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。