姬秀煥 章瓊瑩 池琛 吳谷 李慧敏 陳國榮

糖尿病是嚴(yán)重的國際性公共衛(wèi)生問題。糖尿病腎?。―N）是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥。高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激增強是DN的重要發(fā)病機制，而抗氧化應(yīng)激是防治DN的重要措施[1]。高血糖引起的生長因子表達異常也是DN的重要發(fā)病機制，其中轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的作用尤其突出[2]。研究表明，TGF-β/人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（Smad）信號通路與DN發(fā)生、發(fā)展及腎臟纖維化密切相關(guān)[3]。姜黃素（CUR）是從姜黃的干燥根莖中提取出來的黃色色素，目前許多研究表明CUR對多種疾病具有良好的臟器保護作用[4-6]。然而，CUR在生理條件下不穩(wěn)定、吸收較差，使其應(yīng)用受到了限制。新型CUR類似物J7去除了不穩(wěn)定基團，在代謝、生物利用度等方面均優(yōu)于CUR，能更好地發(fā)揮其藥理作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景[7]。但目前尚無CUR類似物J7對DN保護作用及相關(guān)機制的研究。本研究通過建立2型糖尿病（T2DM）大鼠模型，使用CUR類似物J7、CUR進行藥物干預(yù)，以探討CUR類似物J7對T2DM大鼠腎臟的保護作用及可能機制，為防治DN提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物及試劑 無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠60只，體重180～220g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。CUR類似物J7、CUR均由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院惠贈；羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自上海潤朗生物科技有限公司；胰島素放免試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒及丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)X蛋白（Bax）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠Smad7多克隆抗體均購自美國Antibody Cambridge公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Bioworld公司；山羊抗兔單克隆抗體（二抗）PV6001購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型建立及分組給藥 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用抽簽法隨機分出10只為正常對照（NC）組，其余50只為實驗組。參考文獻[8]的造模步驟，實驗組通過高脂高糖飲食喂養(yǎng)大鼠4周，單次腹腔注射STZ（30mg/kg）誘導(dǎo)T2DM模型。喂養(yǎng)過程中有4只大鼠死亡；喂養(yǎng)結(jié)束后，6只大鼠尾靜脈空腹血糖（FBG）＜16.7mmol/L，造模失敗予以剔除。最終有40只大鼠造模成功。造模成功后，實驗組40只大鼠按抽簽法隨機分為模型組、CUR治療組、J7低劑量（LJ7）治療組、J7高劑量（HJ7）治療組，每組10只。CUR組、LJ7組、HJ7組分別予20mg/kgCUR、10mg/kg J7、20mg/kg J7（CUR、J7 溶于 1%羧甲基纖維素鈉）灌胃1次/d，每次灌胃量按1ml/100g體重計算得出，另兩組分別給予同等容積羧甲基纖維素鈉灌胃，持續(xù)8周。實驗期間，實驗組持續(xù)給予高脂高糖飲食，NC組給予普通飲食。實驗結(jié)束后處死大鼠。

1.3 大鼠體重及腎臟組織稱重 實驗結(jié)束時，使用電子秤測量安靜狀態(tài)下大鼠體重。實驗結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠并作股動脈放血處死，解剖大鼠兩側(cè)完整的腎臟組織，稱重并計算腎重指數(shù)。腎重指數(shù)=腎重（g）/體重（100g）×100.0%。

1.4 血生化指標(biāo)檢測 處死大鼠后收集血清，采用放射免疫法測定FBG，使用自動生化分析儀測定血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.5 腎臟組織病理形態(tài)觀察 （1）HE染色：常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察各組大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)、腎小球平均橫截面積、毛細(xì)血管管腔及系膜區(qū)基質(zhì)增生情況。（2）Masson染色：常規(guī)石蠟切片，紅色Masson液染色，光鏡下觀察腎臟組織中腎小球基底膜和系膜基質(zhì)的膠原纖維染色情況。其中腎小球基底膜和系膜基質(zhì)的膠原纖維被染成亮綠色，細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍色。（3）PAS染色：常規(guī)石蠟切片，Schiff試劑染色，光鏡下觀察腎臟組織中腎小球基底膜和系膜基質(zhì)的膠原纖維染色情況。其中腎小球基底膜和腎小球系膜基質(zhì)被染成紫紅色。（4）電鏡下觀察：制備半薄切片及超薄切片，半薄切片甲苯胺藍染色定位并制作超薄切片（厚度100nm）；醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色；在H-7500日立透射電子顯微鏡下觀察大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)。

1.6 腎臟組織MDA水平及SOD活性檢測 取1g大鼠腎臟組織，加0.9%氯化鈉溶液研磨，制成10%組織勻漿，2 500r/min低溫離心10min，取上清液。二辛可寧酸（BCA）法測定蛋白濃度。上清液稀釋10倍后，采用硫代巴比妥酸法檢測腎皮質(zhì)內(nèi)MDA水平，羥胺法檢測SOD活性，檢測步驟按照試劑盒操作說明進行。

1.7 腎臟組織TGF-β1蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。石蠟切片、脫蠟至水，3%H2O2室溫阻斷20min，高溫高壓修復(fù)，山羊血清封閉，兔抗大鼠TGF-β1一抗（1∶1 000的稀釋比）4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗37℃孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。結(jié)果判讀：以PBS代替一抗作為陰性對照，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒樣物質(zhì)為陽性表達，每張切片隨機選取10個腎皮質(zhì)腎小球高倍鏡視野（400倍）觀察。

1.8 腎臟組織 Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad7 蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法。常規(guī)制備腎臟組織勻漿，Bradford 法檢測 Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad7 蛋白濃度，配膠、上樣、電泳，以恒流230mA轉(zhuǎn)膜90min，5%脫脂牛奶室溫封閉 1.5h，抗 Bax（1∶1 000）、抗 Bcl-2（1∶1 000）、抗 TGF-β1（1∶1 000）、抗 Smad7（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h。化學(xué)發(fā)光顯影定影，以GAPDH抗體為內(nèi)參，使用Bio-Rad Quantity One 4.6凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對各條帶進行相對定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)比較 給藥期間，NC組大鼠體型正常，活動正常，毛發(fā)順滑有光澤；模型組大鼠體型瘦弱，多飲、多食、多尿，行動遲緩，精神萎靡，毛發(fā)干燥、色黃；CUR組、LJ7組和HJ7組癥狀明顯減輕。實驗結(jié)束時各組大鼠體重及腎重指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與NC組比較，模型組大鼠體重明顯降低，腎重指數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，CUR組、LJ7組和HJ7組大鼠體重稍增加，腎重指數(shù)稍下降，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＞0.05），見表 1。

2.2 各組大鼠血生化指標(biāo)比較 實驗結(jié)束時各組大鼠FBG、Scr、BUN水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與NC組比較，模型組FBG、Scr、BUN水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，CUR組、LJ7組和HJ7組FBG水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Scr、BUN水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表1 實驗結(jié)束時各組大鼠體重及腎重指數(shù)比較

表2 實驗結(jié)束時各組大鼠血生化指標(biāo)比較

2.3 大鼠腎臟組織光鏡下組織病理學(xué)變化

2.3.1 各組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果 NC組大鼠腎小球毛細(xì)血管管腔規(guī)則，管壁菲薄，見圖1a（插頁）；模型組大鼠腎小球平均橫截面積增大，腎小球肥大，毛細(xì)血管袢蜷曲紊亂，系膜基質(zhì)增生，見圖1b（插頁）；CUR組、LJ7組和HJ7組腎小球肥大程度較模型組減輕，腎小球平均橫截面積減小，特別HJ7組腎小球體積接近正常，形態(tài)規(guī)則，系膜基質(zhì)增生明顯減少，見圖1c-e（插頁）。

圖1 各組大鼠腎臟組織 HE 染色結(jié)果（a：NC 組；b：模型組；c：CUR 組；d：LJ7 組；e：HJ7 組；×400）

圖2 各組大鼠腎臟組織 Masson 染色結(jié)果（a：NC 組；b：模型組；c：CUR 組；d：LJ7 組；e：HJ7 組；×400）

圖3 各組大鼠腎臟組織 PAS 染色結(jié)果（a：NC 組；b：模型組；c：CUR 組；d：LJ7 組；e：HJ7 組；×400）

圖5 各組大鼠腎臟組織 TGF-β1 免疫組化染色結(jié)果（a：NC 組；b：模型組；c：CUR 組；d：LJ7 組；e：HJ7 組；Envision 染色，×400）

2.3.2 各組大鼠腎臟組織Masson染色結(jié)果 NC組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜可見少量亮綠色膠原纖維，見圖2a（插頁）；模型組大鼠腎小球肥大，亮綠色基底膜和系膜基質(zhì)明顯增多，見圖2b（插頁）；CUR組、LJ7組和HJ7組腎小球肥大程度減輕，腎小球亮綠色膠原纖維較模型組明顯稀疏，HJ7組顯著減少，接近正常腎小球，見圖 2c-e（插頁）。

2.3.3 各組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果 NC組大鼠腎小球紫紅色基底膜和系膜基質(zhì)稀疏，見圖3a（插頁）；模型組大鼠腎小球肥大，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，見圖3b（插頁）。CUR組、LJ7組和HJ7組腎小球肥大程度減輕，基底膜和系膜基質(zhì)紫紅色明顯減少，HJ7組較為顯著，見圖3c-e（插頁）。

2.4 大鼠腎臟組織電鏡下組織病理學(xué)變化 NC組大鼠腎小球基底膜厚薄均勻，足細(xì)胞形態(tài)正常，足突細(xì)長，足細(xì)胞線粒體數(shù)量較多，見圖4a；模型組大鼠腎小球基底膜不同程度增厚且厚薄不均，系膜細(xì)胞邊緣見較多電子密度高的基質(zhì)沉積，足突腫脹變短，足突融合，足細(xì)胞線粒體數(shù)目減少，足細(xì)胞核膜皺縮退變，見圖4b；CUR組、LJ7組和HJ7組基底膜基本恢復(fù)正常，CUR組仍可見部分基底膜厚薄不均，LJ7組、HJ7組基底膜厚薄較均勻，足細(xì)胞形態(tài)相較于模型組恢復(fù)正常，足突未見明顯腫脹、粗短，未見廣泛足突融合現(xiàn)象，足細(xì)胞線粒體數(shù)目較模型組增多，線粒體未見明顯腫脹，其中LJ7組、HJ7組減輕糖尿病腎小球超微結(jié)構(gòu)病變的效果明顯，見圖4c-e。

圖4 透射電鏡下觀察各組大鼠腎臟組織超微結(jié)構(gòu)（a：NC 組；b：模型組；c：CUR 組；d：LJ7 組；e：HJ7 組；×10 000）

2.5 各組大鼠腎臟組織MDA水平和SOD活性比較各組大鼠腎臟組織MDA水平和SOD活性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與NC組比較，模型組大鼠MDA水平明顯升高，SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與模型組比較，CUR組、LJ7組和HJ7組MDA水平明顯降低，HJ7組SOD活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織MDA水平和SOD活性比較

2.6 各組大鼠腎臟組織TGF-β1免疫組化染色結(jié)果NC組腎小球和腎小管細(xì)胞質(zhì)均有弱陽性表達，見圖5a（插頁）；模型組TGF-β1蛋白表達呈強陽性，高倍鏡下見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量染色較深的棕黃色顆粒物彌漫分布，見圖5b（插頁）；CUR組、LJ7組和 HJ7組TGF-β1蛋白陽性表達強度明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見中等染色強度的棕黃色顆粒彌漫分布，見圖5c-e（插頁）。

2.7 各組大鼠腎臟組織 Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad7 蛋白相對表達量及Bcl-Bax比較 各組大鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad7 蛋白相對表達量及 Bcl-2/Bax比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與NC組比較，模型組Bax、TGF-β1蛋白相對表達量均明顯升高，Bcl-2、Smad7蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型組比較，LJ7組、HJ7組Bax、TGF-β1蛋白相對表達量均明顯降低，Bcl-2、Smad7蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；CUR組Bcl-2蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表4和圖6-8。

表4 各組大鼠腎臟組織Bax、Bcl-2、TGF-β1、Smad7蛋白相對表達量及Bcl-Bax比較

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性病，DN是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者病死的主要原因[3]。糖尿病各種臟器并發(fā)癥發(fā)生的主要原因是長期高血糖水平導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體生產(chǎn)過剩的活性氧（ROS），使得氧化應(yīng)激增強，氧化-抗氧化平衡失調(diào)，導(dǎo)致ROS積累與細(xì)胞損傷[9]。研究表明，糖尿病中ROS的積累會誘導(dǎo)β細(xì)胞功能障礙，增加胰島素抵抗，導(dǎo)致糖尿病相關(guān)并發(fā)癥增多[9]。相關(guān)臨床研究表明，ROS在DN和終末期腎病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1，10]。在通常情況下，腎臟通過各種抗氧化劑抵御ROS損傷，如SOD、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX），其中SOD是一種強有力的酶。MDA的產(chǎn)生是由于體內(nèi)增加的ROS攻擊并破壞各種生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝的毒性產(chǎn)物，MDA水平能反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠腎臟組織SOD活性降低，MDA水平升高，提示T2DM大鼠氧化應(yīng)激增強，符合預(yù)期結(jié)果。經(jīng)過CUR類似物J7、CUR藥物干預(yù)后，SOD活性升高，MDA水平降低；提示CUR類似物J7具有抗氧化應(yīng)激的作用，從而減少脂質(zhì)過氧化，降低細(xì)胞損傷的程度。

圖6 各組大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達的電泳圖

圖7 各組大鼠腎臟組織Bax、Bcl-2蛋白表達的電泳圖

圖8 各組大鼠腎臟組織Smad7蛋白表達的電泳圖

氧化應(yīng)激在高血糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用[11]。它能負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存和壽命，并導(dǎo)致程序性的細(xì)胞死亡[12]。Bcl-2蛋白家族（如Bax和Bcl-2）是凋亡相關(guān)蛋白，Bax促進細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax可形成異源二聚體，抑制細(xì)胞色素C釋放，進而抑制其下游凋亡相關(guān)因子Caspase-3的活化，最終抑制細(xì)胞凋亡[11]。Bcl-2/Bax可用來反映抑制細(xì)胞凋亡的能力。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，Bcl-2/Bax明顯下降，提示T2DM大鼠腎臟組織存在細(xì)胞凋亡。在電鏡下觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)，可見模型組大鼠腎小球足突腫脹變短、足突融合、足細(xì)胞線粒體數(shù)目減少、核膜皺縮退變的病理學(xué)改變。經(jīng)CUR類似物J7治療后，Bcl-2/Bax升高，提示J7具有抗糖尿病大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡的作用；足細(xì)胞病理學(xué)改變也相對減輕，提示J7具有保護足細(xì)胞的作用。

TGF-β1信號通路的啟動是糖尿病腎損傷中的一個關(guān)鍵步驟[2]。TGF-β1在DN發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，參與細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的發(fā)展[13]。在DN中，高血糖環(huán)境和氧化應(yīng)激可啟動TGF-β/Smad信號通路，從而促進腎小球系膜基質(zhì)沉積，促進Ⅰ型和Ⅳ型膠原合成，并且通過抑制蛋白酶活性來減少基質(zhì)降解，促進腎小球和腎小管間質(zhì)的纖維化[14-15]。有文獻報道，在動物模型中長期給予抗TGF-β1抗體來阻斷TGF-β1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可抑制腎小球系膜區(qū)增寬[16]。Smad7是抑制性Smad，已知TGF-β1信號通路受Smad7的負(fù)調(diào)控，可抑制DN腎臟組織的纖維化[14]。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠TGF-β1蛋白相對表達量明顯升高，纖維化抑制因子Smad7蛋白相對表達量明顯降低，與Masson染色和PAS染色顯示的模型組大鼠腎小球存在纖維化和基質(zhì)增多的結(jié)果一致；提示TGF-β1蛋白相對表達量升高、Smad7蛋白相對表達量降低可能是引起T2DM大鼠腎臟纖維化和基質(zhì)沉積的重要原因。本實驗造模成功的大鼠經(jīng)CUR類似物J7治療后，TGF-β1蛋白相對表達量降低，Smad7蛋白相對表達量升高，Masson染色和PAS染色結(jié)果顯示相應(yīng)病理學(xué)改變減輕，提示J7具有抗腎纖維化的作用。

綜上所述，CUR類似物J7對T2DM大鼠腎臟組織具有保護作用，下調(diào)氧化應(yīng)激水平可能是其抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡的機制；而直接抑制TGF-β/Smad通路或通過下調(diào)氧化應(yīng)激水平來間接抑制TGF-β/Smad通路可能是其抑制腎組織纖維化的機制。