羅堉暄　楊艷玲　龍冰　林燕斯　許藝川　張祥忠

【摘要】 目的探討STAT3抑制劑Stattic對(duì)急性髓系白血病（AMI） U937與HL60細(xì)胞株的增殖、凋亡及DNA損傷修復(fù)的影響。方法分別以不同濃度Stattic處理U937與HL60細(xì)胞24 h，以細(xì)胞增殖一毒性檢測(cè)試劑（ CCK8）法檢測(cè)白血病細(xì)胞的增殖活性;以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)白血病細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷以及DNA損傷修復(fù)情況。結(jié)果U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.05）。1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加（P< 0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加（P< 0.001），2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2/M期（P<0.05），同時(shí)CO/GI期百分比下降（P<0.01）。1、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期，同時(shí)G2/M期及Gl/CO期百分比下降（P<0.05），HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時(shí)，SubGI百分比升高。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平（P均<0.001）。結(jié)論Stattic可能通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并阻礙其修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】 DNA損傷修復(fù);STAT3抑制劑;急性髓系白血病;凋亡

急性髓系白血病（ AMI）是起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病。目前化學(xué)治療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植仍然是大部分AML患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而僅40% - 70%的患者可通過(guò)化學(xué)治療獲得完全緩解。部分患者對(duì)化學(xué)治療藥物發(fā)生耐藥[1]。對(duì)AML發(fā)病機(jī)制的研究促進(jìn)了各類靶向藥物的開(kāi)發(fā)與使用。PML/RARA融合基因陽(yáng)性急性早幼粒細(xì)胞白血病患者經(jīng)全反式維甲酸聯(lián)合砷劑治療基本可以達(dá)到臨床治愈[2]。而酪氨酸激酶3（ FLT3）抑制劑對(duì)FLT3-ITD突變AML患者療效卻不理想，表現(xiàn)為緩解期短[1]。部分靶向藥物療效持續(xù)時(shí)間短或與腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)。AML發(fā)生耐藥的相關(guān)機(jī)制仍需要深入研究，以尋找新的靶向藥物。

轉(zhuǎn)錄激活因子3（ STAT3）是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子，磷酸化后呈活化狀態(tài)[3]。在大部分腫瘤中STAT3呈持續(xù)活化狀態(tài)[4-6]。抑制STAT3活性可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]。研究顯示STAT3與DNA損傷修復(fù)（ DDR）相關(guān)[9-11]。細(xì)胞發(fā)生基因損傷后即啟動(dòng)DDR。若損傷持續(xù)存在，則細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。許多腫瘤對(duì)放射治療及化學(xué)治療耐藥與腫瘤細(xì)胞DDR功能活躍有關(guān)。在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中，抑制STAT3活性可增加DDR從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。筆者目前尚未見(jiàn)STAT3抑制劑干擾白血病患者腫瘤細(xì)胞DDR的相關(guān)報(bào)道，故擬探討STAT3抑制劑對(duì)AML細(xì)胞的增殖、凋亡和DDR的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

AML細(xì)胞株U937與HL60由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院贈(zèng)予。STAT3抑制劑Stattic購(gòu)于CAYMAN CHEMICAL公司，依托泊苷購(gòu)于Sigma公司，藥物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解后于-20℃保存，使用時(shí)用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋為需要濃度。凋亡檢測(cè)試劑盒、周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司，γ-H2AX熒光標(biāo)記抗體（抗體）購(gòu)于Bio-Legend公司。采用BD公司C6和Calibur流式細(xì)胞儀及Berthold公司多功能酶標(biāo)儀。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

U937和HL60細(xì)胞株復(fù)蘇后，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)于5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度維持在lx 10⁵-lx 10⁶，2-3d更換培養(yǎng)基。

2.細(xì)胞活力檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937與HL60細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度約為1×10⁵/ml;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl，藥物組分別予1、2.5、5、10μM的Stattic處理，陰性對(duì)照組予DMSO處理，空白對(duì)照為培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔;將培養(yǎng)板置于5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;向每孔加入10μl的細(xì)胞增殖一毒性檢測(cè)試劑（ CCK8），將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h;用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度（OD）。增殖抑制率（%）=[1-（OD實(shí)驗(yàn)-OD空自組）/（0D陰性對(duì)照一OD空自組）]×100%

3.AML細(xì)胞周期的檢測(cè)

采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用PBS洗3次后去上清，加入500 μl 70%預(yù)冷乙醇固定2h，用PBS洗去固定液，加入500 μl PI/RNase A染色液（ PI：Rnase A=9：1），室溫避光30 - 60 min，于Calibur流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，用Flowjo-VIO處理圖像。

4.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用預(yù)冷PBS（含2%胎牛血清）洗滌3次后用Bingdingbufferl00μl重懸，加5μl Annexin V-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光15 min。在BD公司C6流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度，調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，用Flowjo-V10處理圖像。

5.細(xì)胞DDR的相關(guān)檢測(cè)

細(xì)胞DDR速度的檢測(cè)：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2、4、6h后，收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品，用PBS洗滌3次后去上清，室溫避光下用4%多聚甲醛重懸，靜置15 min，用PBS洗去4%多聚甲醛后加入預(yù)冷的70%乙醇，將流式管放置于渦旋振蕩器上，振蕩混勻，-20℃下孵育60 min。用PBS洗去乙醇后重懸，加入5 μlγ -H2AX抗體，避光室溫孵育90 min。Calibur流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度。Flowjo-V10處理圖像并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

Stattic對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響：采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品，用PBS洗滌，離心后用前述方法孵育γ-H2AX抗體，在Calibur流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度，用Flowjo-V10處理圖像并計(jì)算MFI。

Stattic對(duì)細(xì)胞DDR的影響：采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后，將各細(xì)胞株分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，分別在含DMSO及2.5 μM Stattic的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后收集各細(xì)胞樣品，離心后用前述方法孵育的γ-H2AX抗體在Calibur流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)lowjo-VIO處理圖像并計(jì)算MFI。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖像均采用Adobe Illustrator和GraphPad Prism處理，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Stattic抑制AML細(xì)胞增殖

CCK8檢測(cè)顯示，U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱（P均<0.001），見(jiàn)表1。

二、Stattic促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡

1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加（P<0.001）;而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加（P<0.001），n=3，見(jiàn)圖1。2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。

三、Stattic阻滯AML細(xì)胞周期

各周期不同Stattic濃度組間比較中，U937：F_SubGl=176.327， F_G0/G1= 67.602， F_s= 43.302， F_G2/M= 70.174; HL60： F_SubGl=902.326， F_G0/G1= 254.493，F(xiàn)_s= 470.447， F_G2/M= 35.438.P均<0.001）。 2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2廠期（P<0.05），同時(shí)GO/G1期百分比下降（P<0.01）。l、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期，同時(shí)G2/M期及G1/GO期百分比下降（P<0.05），HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時(shí)，SubG1百分比升高，提示細(xì)胞凋亡較多。n=3，見(jiàn)圖2。

四、AML細(xì)胞具有DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)能力

依托泊苷誘導(dǎo)U937與HL60細(xì)胞雙鏈斷裂后，U937與HL60γ-H2AX平均熒光水平均高于空白對(duì)照組，明確發(fā)生了DNA雙鏈斷裂。在隨后的2、4、6h后，U937與HL60中的DNA雙鏈斷裂損傷得到了修復(fù)，表現(xiàn)為γ-H2AX熒光水平逐漸下降。n=3，見(jiàn)圖3。

五、Stattic誘導(dǎo)AML細(xì)胞DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)

HL60經(jīng)不同濃度Stattic處理后均發(fā)生了DNA雙鏈斷裂，其程度隨著藥物濃度的增加而增大（F= 38.367.P<0.001）0 U937經(jīng)2.5、5μM Stattic處理后也發(fā)生了DNA雙鏈斷裂（F=399.164，P< 0.001），但經(jīng)1μM Stattic處理后也出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂，但無(wú)前2組明顯。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h，Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平，提示Stattic阻礙了DNA雙鏈斷裂修復(fù)（t_u937=199.7，P< 0.001;t_HL60= 29.11，P<0.001）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示Stattic可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)。

討 論

1995年Yu等首次發(fā)現(xiàn)STAT3與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)，目前，越來(lái)越多的研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，70%的實(shí)體瘤和血液腫瘤具有STAT3活性增強(qiáng)的特性[13]。STAT3可以通過(guò)AKT/STAT3、Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，同時(shí)，STAT3通路異?；罨€會(huì)導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡[7，13]。

STAT3在白血病細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用[14]。Stattic屬于非肽類STAT3小分子抑制劑，特異性地抑制STAT3 SH2結(jié)構(gòu)域的功能，對(duì)STAT5、STATI幾乎沒(méi)有抑制作用，是STAT3抑制劑中特異性較好的小分子抑制劑。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Stattic作用24 h后，AML細(xì)胞HL60及U937的細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期，抑制增殖，這與目前報(bào)道的抑制STAT3活性可以有效地抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖相符[13]。

STAT3的持續(xù)活化可抑制白血病細(xì)胞的凋亡，有研究者在FLT3-ITD突變的細(xì)胞株MV4-11中發(fā)現(xiàn)，p-STAT3的高表達(dá)導(dǎo)致抗凋亡基因Survivin表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，STAT3活化可上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1和ROR1表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[7]。抑制STAT3的活性可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，Stattic能誘導(dǎo)AML細(xì)胞U937和HL60細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度增加，凋亡百分比增加。有研究顯示，在HL60細(xì)胞中抑制STAT3活性可以上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3、P27和P21，同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。然而，STAT3抑制劑對(duì)DDR的影響是否參與了白血病細(xì)胞的凋亡，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)顯示AML細(xì)胞株U937和HL60在依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后可對(duì)受損的DNA進(jìn)行修復(fù)，而在加用Stattic后，DDR速度下降，這提示其可阻礙DDR，從而增加U937和HL60細(xì)胞對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的敏感性。Stattic單藥作用24 h后可誘導(dǎo)U937和HL60細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，并且DNA雙鏈斷裂水平也隨著藥物濃度升高而升高。所以Stattic可通過(guò)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并阻礙細(xì)胞對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，從而促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，增加白血病細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物依托泊苷的敏感性。許多傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物均通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷，最終誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。然而誘導(dǎo)DNA損傷的化學(xué)治療藥物也會(huì)激活DDR反應(yīng)，且大部分腫瘤細(xì)胞具有較高的DNA修復(fù)能力，這是腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療耐藥的主要機(jī)制之一[15]。在A549人肺癌細(xì)胞株CD133+的腫瘤干細(xì)胞中DDR相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，較強(qiáng)的DDR能力是肺癌干細(xì)胞難以清除的原因[16]。因此，阻礙DDR速度是目前突破化學(xué)治療耐藥的重要途徑之一。在非小細(xì)胞肺癌中，奧斯替尼可降低肺癌細(xì)胞DDR速度，從而增加放射治療或致DNA損傷化學(xué)治療藥物的敏感性，減低腫瘤細(xì)胞耐藥率[17]。在白血病細(xì)胞中，西達(dá)本胺能夠下調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因，維持γ-H2AX水平以及增加細(xì)胞對(duì)蒽環(huán)類化學(xué)治療藥物的敏感性[18]。STAT3與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)，在敲除STAT3基因的小鼠胰腺B細(xì)胞中DNA損傷增加[9]。在食管癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均發(fā)現(xiàn)抑制STAT3活性可抑制DNA損傷修復(fù)，提高腫瘤對(duì)放射治療及化學(xué)治療的敏感性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在AML細(xì)胞中，STAT3抑制劑可阻礙DDR。

本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)Stattic可抑制AML細(xì)胞株U937和HL60的增殖，促進(jìn)其凋亡。阻滯細(xì)胞周期于S、G2/M期及誘發(fā)DNA雙鏈斷裂、阻礙DDR是抑制增殖、促進(jìn)凋亡的可能機(jī)制。Stattic通過(guò)影響哪些DNA修復(fù)通路抑制DDR需要進(jìn)一步研究證明。

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