羅堉暄 楊艷玲 龍冰 林燕斯 許藝川 張祥忠
【摘要】 目的探討STAT3抑制劑Stattic對(duì)急性髓系白血病(AMI) U937與HL60細(xì)胞株的增殖、凋亡及DNA損傷修復(fù)的影響。方法分別以不同濃度Stattic處理U937與HL60細(xì)胞24 h,以細(xì)胞增殖一毒性檢測(cè)試劑( CCK8)法檢測(cè)白血病細(xì)胞的增殖活性;以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)白血病細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷以及DNA損傷修復(fù)情況。結(jié)果U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱(P均<0.05)。1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加(P< 0.001);而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加(P< 0.001),2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2/M期(P<0.05),同時(shí)CO/GI期百分比下降(P<0.01)。1、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期,同時(shí)G2/M期及Gl/CO期百分比下降(P<0.05),HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時(shí),SubGI百分比升高。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h,Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平(P均<0.001)。結(jié)論Stattic可能通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生DNA損傷并阻礙其修復(fù)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】 DNA損傷修復(fù);STAT3抑制劑;急性髓系白血病;凋亡
急性髓系白血病( AMI)是起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病。目前化學(xué)治療聯(lián)合造血干細(xì)胞移植仍然是大部分AML患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。然而僅40% - 70%的患者可通過(guò)化學(xué)治療獲得完全緩解。部分患者對(duì)化學(xué)治療藥物發(fā)生耐藥[1]。對(duì)AML發(fā)病機(jī)制的研究促進(jìn)了各類靶向藥物的開(kāi)發(fā)與使用。PML/RARA融合基因陽(yáng)性急性早幼粒細(xì)胞白血病患者經(jīng)全反式維甲酸聯(lián)合砷劑治療基本可以達(dá)到臨床治愈[2]。而酪氨酸激酶3( FLT3)抑制劑對(duì)FLT3-ITD突變AML患者療效卻不理想,表現(xiàn)為緩解期短[1]。部分靶向藥物療效持續(xù)時(shí)間短或與腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)。AML發(fā)生耐藥的相關(guān)機(jī)制仍需要深入研究,以尋找新的靶向藥物。
轉(zhuǎn)錄激活因子3( STAT3)是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子,磷酸化后呈活化狀態(tài)[3]。在大部分腫瘤中STAT3呈持續(xù)活化狀態(tài)[4-6]。抑制STAT3活性可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]。研究顯示STAT3與DNA損傷修復(fù)( DDR)相關(guān)[9-11]。細(xì)胞發(fā)生基因損傷后即啟動(dòng)DDR。若損傷持續(xù)存在,則細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。許多腫瘤對(duì)放射治療及化學(xué)治療耐藥與腫瘤細(xì)胞DDR功能活躍有關(guān)。在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中,抑制STAT3活性可增加DDR從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。筆者目前尚未見(jiàn)STAT3抑制劑干擾白血病患者腫瘤細(xì)胞DDR的相關(guān)報(bào)道,故擬探討STAT3抑制劑對(duì)AML細(xì)胞的增殖、凋亡和DDR的影響。
材料與方法
一、實(shí)驗(yàn)材料
AML細(xì)胞株U937與HL60由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院贈(zèng)予。STAT3抑制劑Stattic購(gòu)于CAYMAN CHEMICAL公司,依托泊苷購(gòu)于Sigma公司,藥物均用二甲基亞砜(DMSO)溶解后于-20℃保存,使用時(shí)用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋為需要濃度。凋亡檢測(cè)試劑盒、周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司,γ-H2AX熒光標(biāo)記抗體(抗體)購(gòu)于Bio-Legend公司。采用BD公司C6和Calibur流式細(xì)胞儀及Berthold公司多功能酶標(biāo)儀。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1.細(xì)胞培養(yǎng)
U937和HL60細(xì)胞株復(fù)蘇后,用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基+ 10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)于5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,細(xì)胞密度維持在lx 105-lx 106,2-3d更換培養(yǎng)基。
2.細(xì)胞活力檢測(cè)
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937與HL60細(xì)胞株,調(diào)整細(xì)胞密度約為1×105/ml;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中,每孔100μl,藥物組分別予1、2.5、5、10μM的Stattic處理,陰性對(duì)照組予DMSO處理,空白對(duì)照為培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔;將培養(yǎng)板置于5%二氧化碳、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h;向每孔加入10μl的細(xì)胞增殖一毒性檢測(cè)試劑( CCK8),將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h;用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD)。增殖抑制率(%)=[1-(OD實(shí)驗(yàn)-OD空自組)/(0D陰性對(duì)照一OD空自組)]×100%
3.AML細(xì)胞周期的檢測(cè)
采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品,用PBS洗3次后去上清,加入500 μl 70%預(yù)冷乙醇固定2h,用PBS洗去固定液,加入500 μl PI/RNase A染色液( PI:Rnase A=9:1),室溫避光30 - 60 min,于Calibur流式細(xì)胞儀上檢測(cè),用Flowjo-VIO處理圖像。
4.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品,用預(yù)冷PBS(含2%胎牛血清)洗滌3次后用Bingdingbufferl00μl重懸,加5μl Annexin V-FITC和5μlPI,輕輕混勻,室溫避光15 min。在BD公司C6流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度,調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償,用Flowjo-V10處理圖像。
5.細(xì)胞DDR的相關(guān)檢測(cè)
細(xì)胞DDR速度的檢測(cè):采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別培養(yǎng)0、2、4、6h后,收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品,用PBS洗滌3次后去上清,室溫避光下用4%多聚甲醛重懸,靜置15 min,用PBS洗去4%多聚甲醛后加入預(yù)冷的70%乙醇,將流式管放置于渦旋振蕩器上,振蕩混勻,-20℃下孵育60 min。用PBS洗去乙醇后重懸,加入5 μlγ -H2AX抗體,避光室溫孵育90 min。Calibur流式細(xì)胞儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度。Flowjo-V10處理圖像并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
Stattic對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的影響:采用不同濃度Stattic處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株24 h后收集各細(xì)胞樣品,用PBS洗滌,離心后用前述方法孵育γ-H2AX抗體,在Calibur流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度,用Flowjo-V10處理圖像并計(jì)算MFI。
Stattic對(duì)細(xì)胞DDR的影響:采用終濃度為6μg/ml的依托泊苷處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U937與HL60細(xì)胞株,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。洗脫藥物后,將各細(xì)胞株分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組,分別在含DMSO及2.5 μM Stattic的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),6h后收集各細(xì)胞樣品,離心后用前述方法孵育的γ-H2AX抗體在Calibur流式細(xì)胞儀上測(cè)熒光強(qiáng)度,F(xiàn)lowjo-VIO處理圖像并計(jì)算MFI。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
圖像均采用Adobe Illustrator和GraphPad Prism處理,所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示,2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
一、Stattic抑制AML細(xì)胞增殖
CCK8檢測(cè)顯示,U937與HL60的增殖活性隨著Stattic濃度的升高而減弱(P均<0.001),見(jiàn)表1。
二、Stattic促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡
1、2.5、5μM的Stattic均可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡增加(P<0.001);而U937僅在2.5、5μM濃度的Stattic處理后細(xì)胞凋亡才增加(P<0.001),n=3,見(jiàn)圖1。2種AML細(xì)胞凋亡比率均隨著Stattic藥物濃度增大而增加。
三、Stattic阻滯AML細(xì)胞周期
各周期不同Stattic濃度組間比較中,U937:FSubGl=176.327, FG0/G1= 67.602, Fs= 43.302, FG2/M= 70.174; HL60: FSubGl=902.326, FG0/G1= 254.493,F(xiàn)s= 470.447, FG2/M= 35.438.P均<0.001)。 2.5、5μM濃度的Stattic可將U937細(xì)胞周期阻滯在G2廠期(P<0.05),同時(shí)GO/G1期百分比下降(P<0.01)。l、2.5μM濃度的Stattic將HL60細(xì)胞周期阻滯在S期,同時(shí)G2/M期及G1/GO期百分比下降(P<0.05),HL60細(xì)胞在Stattic 5μM時(shí),SubG1百分比升高,提示細(xì)胞凋亡較多。n=3,見(jiàn)圖2。
四、AML細(xì)胞具有DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)能力
依托泊苷誘導(dǎo)U937與HL60細(xì)胞雙鏈斷裂后,U937與HL60γ-H2AX平均熒光水平均高于空白對(duì)照組,明確發(fā)生了DNA雙鏈斷裂。在隨后的2、4、6h后,U937與HL60中的DNA雙鏈斷裂損傷得到了修復(fù),表現(xiàn)為γ-H2AX熒光水平逐漸下降。n=3,見(jiàn)圖3。
五、Stattic誘導(dǎo)AML細(xì)胞DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)
HL60經(jīng)不同濃度Stattic處理后均發(fā)生了DNA雙鏈斷裂,其程度隨著藥物濃度的增加而增大(F= 38.367.P<0.001)0 U937經(jīng)2.5、5μM Stattic處理后也發(fā)生了DNA雙鏈斷裂(F=399.164,P< 0.001),但經(jīng)1μM Stattic處理后也出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂,但無(wú)前2組明顯。經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后6h,Stattic處理后的U937與HL60細(xì)胞中γ-H2AX熒光強(qiáng)度仍維持在較高水平,提示Stattic阻礙了DNA雙鏈斷裂修復(fù)(tu937=199.7,P< 0.001;tHL60= 29.11,P<0.001)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示Stattic可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂并阻礙其修復(fù)。
討 論
1995年Yu等首次發(fā)現(xiàn)STAT3與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān),目前,越來(lái)越多的研究證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn),70%的實(shí)體瘤和血液腫瘤具有STAT3活性增強(qiáng)的特性[13]。STAT3可以通過(guò)AKT/STAT3、Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖,同時(shí),STAT3通路異?;罨€會(huì)導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)失衡[7,13]。
STAT3在白血病細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用[14]。Stattic屬于非肽類STAT3小分子抑制劑,特異性地抑制STAT3 SH2結(jié)構(gòu)域的功能,對(duì)STAT5、STATI幾乎沒(méi)有抑制作用,是STAT3抑制劑中特異性較好的小分子抑制劑。在本次實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)Stattic作用24 h后,AML細(xì)胞HL60及U937的細(xì)胞周期阻滯在S、G2/M期,抑制增殖,這與目前報(bào)道的抑制STAT3活性可以有效地抑制急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖相符[13]。
STAT3的持續(xù)活化可抑制白血病細(xì)胞的凋亡,有研究者在FLT3-ITD突變的細(xì)胞株MV4-11中發(fā)現(xiàn),p-STAT3的高表達(dá)導(dǎo)致抗凋亡基因Survivin表達(dá)上調(diào),抑制細(xì)胞凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中,STAT3活化可上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1和ROR1表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡[7]。抑制STAT3的活性可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中,Stattic能誘導(dǎo)AML細(xì)胞U937和HL60細(xì)胞凋亡,隨著藥物濃度增加,凋亡百分比增加。有研究顯示,在HL60細(xì)胞中抑制STAT3活性可以上調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3、P27和P21,同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。然而,STAT3抑制劑對(duì)DDR的影響是否參與了白血病細(xì)胞的凋亡,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)顯示AML細(xì)胞株U937和HL60在依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂后可對(duì)受損的DNA進(jìn)行修復(fù),而在加用Stattic后,DDR速度下降,這提示其可阻礙DDR,從而增加U937和HL60細(xì)胞對(duì)依托泊苷誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的敏感性。Stattic單藥作用24 h后可誘導(dǎo)U937和HL60細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂,并且DNA雙鏈斷裂水平也隨著藥物濃度升高而升高。所以Stattic可通過(guò)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂并阻礙細(xì)胞對(duì)DNA雙鏈斷裂的修復(fù),從而促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡,增加白血病細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物依托泊苷的敏感性。許多傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物均通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷,最終誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡。然而誘導(dǎo)DNA損傷的化學(xué)治療藥物也會(huì)激活DDR反應(yīng),且大部分腫瘤細(xì)胞具有較高的DNA修復(fù)能力,這是腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療耐藥的主要機(jī)制之一[15]。在A549人肺癌細(xì)胞株CD133+的腫瘤干細(xì)胞中DDR相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào),較強(qiáng)的DDR能力是肺癌干細(xì)胞難以清除的原因[16]。因此,阻礙DDR速度是目前突破化學(xué)治療耐藥的重要途徑之一。在非小細(xì)胞肺癌中,奧斯替尼可降低肺癌細(xì)胞DDR速度,從而增加放射治療或致DNA損傷化學(xué)治療藥物的敏感性,減低腫瘤細(xì)胞耐藥率[17]。在白血病細(xì)胞中,西達(dá)本胺能夠下調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因,維持γ-H2AX水平以及增加細(xì)胞對(duì)蒽環(huán)類化學(xué)治療藥物的敏感性[18]。STAT3與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān),在敲除STAT3基因的小鼠胰腺B細(xì)胞中DNA損傷增加[9]。在食管癌及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均發(fā)現(xiàn)抑制STAT3活性可抑制DNA損傷修復(fù),提高腫瘤對(duì)放射治療及化學(xué)治療的敏感性[10-11]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在AML細(xì)胞中,STAT3抑制劑可阻礙DDR。
本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)Stattic可抑制AML細(xì)胞株U937和HL60的增殖,促進(jìn)其凋亡。阻滯細(xì)胞周期于S、G2/M期及誘發(fā)DNA雙鏈斷裂、阻礙DDR是抑制增殖、促進(jìn)凋亡的可能機(jī)制。Stattic通過(guò)影響哪些DNA修復(fù)通路抑制DDR需要進(jìn)一步研究證明。
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