張翠，司君增，鄭立峰

（萊蕪市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 萊蕪 271100）

腦梗死又稱缺血性腦卒中，其發(fā)病率逐年升高，動脈粥樣硬化尤其是頸動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是腦梗死的主要病因和危險因素[1]。MicroRNA（miRNA）在動脈粥樣硬化性腦梗死（atherosclerosis cerebral infarction，ACI）調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[2]。研究顯示，MicroRNA-126（miR-126）在ApoE（-/-）小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中表達降低，推測其可能參與AS的形成過程[3]，但作用機制尚不清楚。本研究旨在觀察miR-126在ACI患者血清中的表達變化及其對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響，并探討其可能的調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月—2017年11月萊蕪市人民醫(yī)院發(fā)病7 d內(nèi)就診的150例急性腦梗死患者。納入標準：①符合第四屆全國腦血管病會議修訂的診斷標準[4]，經(jīng)顱腦CT或MRI證實；②第1次發(fā)生急性腦梗死；③患者知情同意。排除標準：①既往有腦血管史；②合并有心、肝及腎功能不全和腫瘤、自身免疫性疾病等；③入院前6個月有服用降脂藥物史。150例急性腦梗死患者依據(jù)新TOAST卒中分類標準，分為ACI組110例和非動脈粥樣硬化性腦梗死（non atherosclerosis cerebral infarction，NACI）組患者40例。ACI組：男性60例，女性50例；年齡（66.47±7.99）歲。ACI組患者又根據(jù)頸動脈彩色多普勒超聲結(jié)果分為穩(wěn)定斑塊患者74例和不穩(wěn)定斑塊患者36例。NACI組：男性23例，女性17例；年齡（65.99±8.24）歲。同時選擇同期40例年齡、性別相匹配的健康志愿者作為對照組，對照組行彩色多普勒超聲檢查排除AS。對照組：男性22例，女性18例；年齡（66.11±7.14）歲。所有受試者采集空腹外周靜脈血10 ml，3 000 r/min離心10 min分離血清，-80℃保存待檢。3組性別、年齡、舒張壓（DBP）、空腹血糖（FPG）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而收縮壓（SBP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。見表1。

1.2 主要試劑和細胞系

血清miRNA提取試劑盒（美國Ambion公司），miR-126模擬物、模擬物陰性對照、miR-126抑制物及抑制物陰性對照均購自廣州銳博生物公司，Trizol試劑及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生生物工程公司，miR-126、U6引物購自上海吉瑪制藥公司，CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Transwell小室（美國Corning公司），一抗基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloprotein，MMP-13）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及二抗均購自美國Santa Cruz公司。人血管平滑肌細胞系HA-VSMC（美國ATCC細胞庫）。在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳CO2的飽和濕度恒溫箱培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

表1 3組患者一般資料比較

續(xù)表1

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR應(yīng)用Trizol試劑提取細胞總RNA，用miRNA提取試劑盒提取血清中的miRNA，鑒定純度和含量后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用miR-126特異性逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系進行PCR反應(yīng)。miR-126引物序列，正向引物：5＇-GGCTTCGTACCGTGAGTAAT-3＇，反向引物：5＇-GTGCAGGGTCCGAGGT-3＇。PCR反應(yīng)條件：95℃預 變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算miR-126相對表達水平。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期HA-VSMC細胞，接種于6孔細胞板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞增長至50%～60%密度時，即可進行細胞轉(zhuǎn)染。采用LipofectamineTM2000說明書操作，分別將miR-126模擬物、模擬物陰性對照、miR-126抑制物及抑制物陰性對照轉(zhuǎn)染至HA-VSMC細胞，轉(zhuǎn)染后HA-VSMC細胞分為miR-126模擬物組、模擬物陰性對照組、miR-126抑制物組及抑制物陰性對照組。轉(zhuǎn)染后24 h，采用qRT-PCR檢測各組細胞miR-126的表達水平，評估轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 CCK-8法收集轉(zhuǎn)染后48 h的4組HAVSMC細胞，以5 000個/孔的密度接種于96孔細胞板，每組設(shè)5個復孔，參照CCK-8試劑盒說明書在避光條件下加入10μl CCK-8反應(yīng)液后，置入細胞孵育箱中37℃繼續(xù)孵育4 h后，在酶標儀上設(shè)定波長450 nm，檢測各孔的光密度（optical density，OD）值，以O(shè)D值表示細胞的增殖活性。

1.3.4 Transwell遷移實驗收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組HA-VSMC細胞，以無血清培養(yǎng)基重懸制備單細胞懸液，取0.1 ml單細胞懸液（含1×105個細胞）加入Transwell小室的上室，下室加入0.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入細胞孵育箱中繼續(xù)孵育24 h后取出小室，棉簽輕輕擦棄小室上室的細胞，小室膜上的細胞以95%乙醇溶液固定，染色后顯微鏡下觀察，并隨機取10個高倍視野計算遷移細胞數(shù)，以穿膜細胞數(shù)表示細胞的遷移能力。

1.3.5 Western blotting收集轉(zhuǎn)染后48 h的4組HA-VSMC細胞，加入細胞裂解液和蛋白酶/磷酸酶抑制劑提取細胞總蛋白質(zhì)，BCA法定量蛋白質(zhì)濃度。取200μl樣品上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜，室溫條件下脫脂奶粉封閉2 h后，緩沖液漂洗3遍，分別加入一抗MMP-13和GAPDH，4℃過夜，緩沖液漂洗3遍，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影液顯影，采集圖片，Image Lab軟件分析條帶灰度。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步的兩兩比較用SNK-q檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清中miR-126表達比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，對照組、ACI組和NACI組血清中miR-126的表達水平分別為（1.01±0.04）、（0.97±0.08）和（0.60±0.14），3組血清中miR-126表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=270.240，P=0.000）；ACI組血清中miR-126的表達水平低于NACI組和對照組（P＜0.05），NACI組和對照組血清中miR-126表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 3組血清miR-126表達水平比較 （±s）

ACI組中不穩(wěn)定斑塊和穩(wěn)定斑塊患者血清中miR-126表達水平分別為（0.42±0.08）和（0.69±0.17）。ACI組中不穩(wěn)定斑塊患者血清中miR-126表達水平低于穩(wěn)定斑塊患者（t=9.039，P=0.000）。見圖2。

2.2 各組HA-VSMC細胞miR-126表達水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-126模擬物組、模擬物陰性對照組、miR-126抑制物組和抑制物陰性對照組miR-126表達水平分別為（7.10±0.30）、（1.02±0.04）、（0.35±0.10）和（1.00±0.05）。4組miR-126表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=1158.600，P=0.000）；miR-126模擬物組miR-126表達水平高于模擬物陰性對照組（P＜0.05），miR-126抑制物組miR-126的表達水平低于抑制物陰性對照組（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染效率較高。見圖3。

圖3 各組miR-126表達水平比較 （±s）

2.3 各組HA-VSMC 細胞增殖活性比較

CCK-8法結(jié)果顯示，miR-126模擬物組、模擬物陰性對照組、miR-126抑制物組和抑制物陰性對照組細胞OD值分別為（1.45±0.12）、（2.10±0.10）、（2.62±0.18）和（2.05±0.13）。4組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=37.300，P=0.000）；miR-126模擬物組細胞的OD值低于模擬物陰性對照組（P＜0.05），miR-126抑制物組細胞的OD值高于抑制物陰性對照組（P＜0.05）。說明上調(diào)HA-VSMC細胞miR-126表達能抑制細胞增殖活性，而下調(diào)HAVSMC細胞miR-126表達卻能增強細胞增殖活性。見圖4。

2.4 各組HA-VSMC細胞的遷移能力比較

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，miR-126模擬物組、模擬物陰性對照組、miR-126抑制物組和抑制物陰性對照組遷移細胞數(shù)分別為（19.20±5.00）、（28.10±3.00）、（28.00±5.00）和（40.50±6.00）個。4組遷移細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.690，P=0.005）；miR-126模擬物組遷移細胞數(shù)低于模擬物陰性對照組（P＜0.05），miR-126抑制物組遷移細胞數(shù)低于抑制物陰性對照組（P＜0.05）。說明上調(diào)HAVSMC細胞miR-126表達能抑制細胞遷移能力，而下調(diào)HA-VSMC細胞miR-126表達卻能提高細胞遷移能力。見圖5、6。

圖4 4組細胞增殖活性比較 （±s）

2.5 miR-126靶基因的預測

查閱TargetScan（http：//www.targetscan.org）和miRanda（www.microrna.org）生物信息學數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，miR-126與MMP-13的3’UTR區(qū)存在種子序列互補的結(jié)合位點。結(jié)合相關(guān)文獻[5]，推測MMP-13可能是miR-126的作用靶基因。見圖7。

圖5 各組細胞遷移能力 （×200）

圖6 各組細胞遷移能力比較 （±s）

2.6 各組HA-VSMC細胞MMP-13蛋白表達比較

Western blotting結(jié)果顯示，miR-126模擬物組、模擬物陰性對照組、miR-126抑制物組和抑制物陰性對照組MMP-13蛋白表達水平分別為（0.32±0.13）、（0.95±0.15）、（1.69±0.23）、（0.88±0.19）μg/L。4組MMP-13蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=29.560，P=0.000）；miR-126模擬物組MMP-13蛋白表達水平低于模擬物陰性對照組（P＜0.05），miR-126抑制物組MMP-13蛋白表達水平高于抑制物陰性對照組（P＜0.05）。說明上調(diào)HA-VSMC細胞miR-126表達能抑制細胞MMP-13蛋白表達，而下調(diào)HA-VSMC細胞miR-126表達卻能提高細胞MMP-13蛋白表達。見圖8。

圖7 miR-126和MMP-13的3’UTR區(qū)結(jié)合序列

圖8 4組MMP-13蛋白的表達

3 討論

AS是多種缺血性心腦血管疾病的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細胞損傷和炎癥激活、平滑肌細胞增殖和遷移、單核巨噬細胞活化釋放炎癥介質(zhì)是AS發(fā)生、發(fā)展的重要過程，也是ACI發(fā)生的病理基礎(chǔ)[6]。目前研究證實，血管平滑肌的異常增殖及遷移在促進AS及ACI的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[7]。

近年來研究顯示，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，廣泛參與AS發(fā)病機制的多個環(huán)節(jié)[2]。miR-126是近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤、炎癥反應(yīng)及細胞增殖分化等密切相關(guān)miRNA家族成員之一，其編碼基因定位于染色體9q34.3，表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域1基因的第7個內(nèi)含子中[8-9]。miR-126與AS的關(guān)系引起學者關(guān)注。WANG等[10]研究中發(fā)現(xiàn)，miR-126在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清中表達水平降低，且在不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者血清中表達水平更低，推測miR-126與AS有關(guān)。王婷等[3]研究中發(fā)現(xiàn)，miR-126在ApoE（-/-）小鼠頸AS斑塊中的表達降低，認為miR-126參與頸AS的形成和發(fā)展過程。但目前有關(guān)miR-126在ACI患者血清中表達情況及作用機制的研究尚未見報道。本研究中，筆者通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，ACI患者血清中miR-126的表達水平低于NACI患者和對照組，而NACI患者和健康對照組比較無差異；進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，ACI組中不穩(wěn)定斑塊患者血清中miR-126的表達水平低于穩(wěn)定斑塊患者，提示miR-126在ACI的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[7]。miRNA能通過調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖、凋亡及遷移參與AS的發(fā)生、發(fā)展。李曉麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181b在頸AS患者血清中表達降低，其可能通過抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移起到抗AS的作用。XIE等[12]報道，上調(diào)血管平滑肌細胞中miR-599的表達能抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力，從而干預AS的進展。為研究miR-126是否也能通過影響血管平滑肌細胞增殖和遷移參與ACI的發(fā)生、發(fā)展，筆者通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-126模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染入人血管平滑肌細胞HA-VSMC中，上調(diào)或下調(diào)細胞中miR-126的表達水平。CCK-8實驗和Transwell實驗顯示，上調(diào)HA-VSMC細胞中miR-126水平能抑制細胞的增殖和遷移能力，而下調(diào)miR-126水平卻能提高細胞的增殖和遷移能力。證實miR-126能通過抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力，起到抗AS的作用。

miR-126抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力的下游通路尚不明確。筆者通過生物學信息網(wǎng)站預測MMP-13可能是miR-126的作用靶基因，近期WU等[5]在研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-126通過靶向調(diào)控MMP-13，從而調(diào)控骨巨細胞瘤的分化。MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員之一。研究證實，MMP-13與血管平滑肌細胞的增殖、凋亡、遷移、血管收縮及血栓形成等AS病變過程有關(guān)[13]。抑制MMP-13能減少膠原在頸動脈斑塊中的聚集，甚至增加已形成的斑塊的穩(wěn)定性[14]。為研究miR-126在血管平滑肌細胞中能否也可通過調(diào)控MMP-13影響細胞的增殖和遷移能力。筆者通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HA-VSMC細胞中miR-126水平能下調(diào)細胞中MMP-13表達水平，而下調(diào)miR-126水平卻能升高細胞中MMP-13表達水平，提示miR-126可能通過調(diào)控MMP-13表達調(diào)控血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，miR-126在ACI患者血清中表達降低，miR-126能通過抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，起到抗AS的作用，其機制可能與下調(diào)MMP-13的表達有關(guān)。