張巧蓮， 李雙英， 李 平

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科， 天津 3001062)

臨床上慢性疼痛患者常常伴有抑郁癥的發(fā)生，而部分抑郁癥患者也有慢性軀體疼痛癥狀[1]。因此，疼痛與抑郁發(fā)生之間的關(guān)系成為近來研究關(guān)注的問題[2-4]。研究表明，慢性疼痛可以誘導(dǎo)出抑郁相關(guān)行為。目前神經(jīng)痛的藥物治療僅能緩解癥狀，不能終止或逆轉(zhuǎn)外周神經(jīng)的損傷，并且劇烈的神經(jīng)痛對(duì)藥物的反應(yīng)不佳,雖然有足夠的資料支持阿片藥物的有效性，可與最好的可用的抗抑郁藥和抗驚厥藥相媲美，但由于阿片類藥物存在耐藥性及成癮性，因此對(duì)阿片藥物治療慢性神經(jīng)病理性疼痛仍存在廣泛爭(zhēng)議。人參皂苷Rg2具有神經(jīng)保護(hù)作用、抗缺血/再灌注損傷、抗凋亡和抗抑郁作用[5]，本研究通過建立大鼠慢性坐骨神經(jīng)損傷模型(chronic constriction injury, CCI)，通過腹腔注射給予人參皂苷Rg2，觀察藥物對(duì)CCI大鼠反映痛覺敏感的指標(biāo)機(jī)械性縮足反射閾值和熱輻射縮足潛伏期以及反映焦慮、抑郁表現(xiàn)的指標(biāo)明暗箱測(cè)試觀察大鼠在明箱內(nèi)時(shí)間、穿梭次數(shù)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察大鼠游泳潛伏期、不動(dòng)時(shí)間的影響，為神經(jīng)病理性疼痛的臨床治療提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD 大鼠50只， 月齡(5～6) 月，體重(180～200) g，SPF級(jí)，出售單位為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證為SKXK(京)2016-0006。人參皂苷Rg2(吉林省中醫(yī)中藥研究院)。電針儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備廠，型號(hào)G6805-2)；光照測(cè)痛儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備廠，型號(hào)YLS-12A)，明暗箱(MK-Animex，型號(hào)DSE)。

1.2 慢性坐骨神經(jīng)損傷模型[6]的建立

SD大鼠稱重，用2%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液腹腔注射3 ml/kg進(jìn)行麻醉，用理發(fā)器剔除SD 大鼠右下肢毛發(fā)，碘酒消毒后，剪開皮膚，用玻璃分針充分暴露股后外側(cè)坐骨神經(jīng)干，在其分叉處開始，每間隔 1 mm，用 4 根 320 的鉻制羊腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，松緊度，以不影響坐骨神經(jīng)干的血液供應(yīng)為準(zhǔn)，切口逐層縫合，然后用酒精將縫合皮膚表面血液擦拭干凈，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余操作與模型組一致。手術(shù)結(jié)束后，大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，以防咬傷，正常飲水?dāng)z食。

1.3 動(dòng)物分組及處理

50只大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：(1)正常對(duì)照組( Normal+生理鹽水)；(2)假手術(shù)組(Sham+生理鹽水)：(3)坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷組(CCI+生理鹽水)；(4)人參皂苷Rg2低劑量治療組(CCI+Rg25 mg/kg)；(5)人參皂苷Rg2高劑量治療組(CCI+Rg210 mg/kg)，生理鹽水及Rg2均為腹腔注射。正常對(duì)照組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

手術(shù)前1 d 和手術(shù)第14日首先檢測(cè)各組大鼠的機(jī)械性縮足反射閾值、熱縮足潛伏期，然后進(jìn)行明暗箱測(cè)試、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。手術(shù)后第 1、3、5、7、10日時(shí)檢測(cè)各組大鼠的機(jī)械性縮足反射閾值、熱縮足潛伏期。明暗箱測(cè)試觀察大鼠在明箱內(nèi)時(shí)間、穿梭次數(shù)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察大鼠游泳潛伏期、不動(dòng)時(shí)間。

1.4.1 機(jī)械性縮足反射閾值[7]測(cè)定 采用von Frey 細(xì)絲方法，將機(jī)械測(cè)痛儀放置在水平桌面上，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境，實(shí)驗(yàn)開始前將SD大鼠放置在儀器的有機(jī)玻璃箱中距離桌面約30 cm的金屬網(wǎng)架上，適應(yīng)10 min開始測(cè)量。刺激大鼠足底部選用不同的Von Frey 細(xì)絲，折力由小到大，足底部中央刺激部位保持各組一致，觀察大鼠縮足反應(yīng)的時(shí)間，即機(jī)械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)，每次測(cè)量間隔2～3 min，取 3 次測(cè)量的平均值作為觀察結(jié)果。

1.4.2 熱縮足潛伏期[8]測(cè)定 采用光照輻射刺激痛覺測(cè)試儀，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，儀器玻璃箱的溫度控制在37℃，保持安靜明亮的環(huán)境，實(shí)驗(yàn)開始前將SD大鼠進(jìn)行環(huán)境預(yù)適應(yīng)再開始實(shí)驗(yàn)，將光源聚光后照射到SD大鼠足底部，觀察大鼠縮足反應(yīng)情況，當(dāng)選定一定強(qiáng)度的光源，照射達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，足底快速移開有機(jī)玻璃箱底面而出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，測(cè)定過程中保持有機(jī)玻璃箱底板干燥、清潔，以免影響測(cè)量結(jié)果，觀察和記錄由照射到SD大鼠出現(xiàn)縮足的時(shí)間作為熱縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency, PWL)， 設(shè)置最大光照時(shí)間為25 s，如25 s仍不縮足者記為熱縮足潛伏期為25 s，測(cè)量3次取平均值作為觀察結(jié)果。

1.4.3 明暗箱實(shí)驗(yàn) 明暗箱檢測(cè)系統(tǒng)包括穿梭箱和記錄系統(tǒng)兩部分。穿梭箱分為3個(gè)不透明室，A室和B室較大，并排放置，為條件訓(xùn)練室；C室較小，位于A室和B室前面，各室之間通過可以移動(dòng)的門相通。A室為黑色室壁，B室為白色室壁，大鼠具有趨黑的特性，喜歡停留在A室內(nèi)，C室三壁透明可以用于適應(yīng)環(huán)境。圖像采集系統(tǒng)安裝在明暗箱頂部正中，并與計(jì)算機(jī)相連，可以追蹤觀察大鼠的活動(dòng)情況，統(tǒng)計(jì)大鼠從明箱放入10 min，在明箱中的停留時(shí)間和穿梭次數(shù)。室溫控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境。

1.4.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 大鼠游泳桶高度為60 cm，直徑為30 cm，保持加水深度為40 cm。水溫控制在(25±1)℃，保持安靜明亮的環(huán)境。將大鼠從固定位置放入游泳桶內(nèi)開始計(jì)時(shí)，記錄大鼠開始游泳的時(shí)間即游泳潛伏期以及從開始計(jì)時(shí)5 min內(nèi)的累積不動(dòng)的時(shí)間。游泳5 min結(jié)束后，取出大鼠，用干紗布拭去皮膚毛發(fā)大部分水后，放回籠中飼養(yǎng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg2 對(duì)大鼠機(jī)械性縮足反射閾值的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d至1 d機(jī)械性縮足反射閾值均在14 s左右，假手術(shù)組大鼠手術(shù)前與手術(shù)后機(jī)械性縮足反射閾值未見明顯變化，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠機(jī)械性縮足反射閾值手術(shù)后逐漸降低，7 d時(shí)最低，人參皂苷Rg2低、高劑量組與模型組相比，治療后3 d、7 d、14 d時(shí)械性縮足反射閾值顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，說明人參皂苷Rg2能抑制大鼠機(jī)械性疼痛，并且濃度越高，效果越明顯(表 1)。

2.2 人參皂苷Rg2對(duì)大鼠光輻射熱縮足反射潛伏期的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d機(jī)械性縮足反射潛伏期均在21 s左右，假手術(shù)組大鼠手術(shù)前與手術(shù)后機(jī)械性縮足反射閾值未見明顯變化，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠機(jī)械性縮足反射閾值手術(shù)后逐漸降低，7 d時(shí)最低，人參皂苷Rg2低劑量組治療后7 d、14 d時(shí)，高劑量組3 d、7 d、14 d時(shí)與模型組相比，機(jī)械性縮足反射閾值明顯延長(zhǎng) (P<0.01)，說明人參皂苷Rg2能抑制大鼠機(jī)械性疼痛，并且濃度越高，效果越明顯(表2)。

2.3 人參皂苷Rg2對(duì)大鼠在明箱內(nèi)時(shí)間和穿梭次數(shù)的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d在明箱內(nèi)時(shí)間和穿梭次數(shù)沒有顯著性差異，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠手術(shù)14 d時(shí)，與假手術(shù)組比較，在明箱內(nèi)時(shí)間顯著縮短(P<0.01)，在明箱內(nèi)穿梭次數(shù)顯著減少(P< 0.01)。人參皂苷Rg2低劑量組治療后手術(shù)14 d時(shí)，與模型組相比，在明箱內(nèi)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P< 0.01)，穿梭次數(shù)明顯增加(P<0.01，表3)。

2.4 人參皂苷Rg2對(duì)大鼠游泳潛伏期和不動(dòng)時(shí)間的影響

各組大鼠手術(shù)前1 d水中游泳潛伏期沒有顯著性差異，慢性坐骨神經(jīng)損傷模型組大鼠手術(shù)14 d時(shí)，與假手術(shù)組比較，水中游泳潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。人參皂苷Rg2低劑量組治療后手術(shù)14 d時(shí)，與模型組相比，水中游泳潛伏期顯著縮短(P< 0.01)。各組大鼠手術(shù)前1 d手術(shù)第14日水中5 min內(nèi)不動(dòng)時(shí)間沒有顯著性差異(P<0.01，表4)。

Tab. 1 Effects of ginsenoside Rg2 on the threshold of mechanical shrinkage foot reflex in rats (s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 2 Effects of ginsenoside Rg2 on the thermal withdrawal latency in rats (s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 3 Effects of ginsenoside Rg2 on the time in the light compartment and the number of transition of rats n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

Tab. 4 Effects of ginsenoside Rg2 on swimming latency and immobility time in rats(s, n=10)

**P<0.01vssham group or normal group;##P<0.01vsCCI group

3 討論

迄今為止，對(duì)神經(jīng)性病理性疼痛發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床上屬于一種比較復(fù)雜的慢性疼痛，中藥在防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面具有多靶點(diǎn)、無耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。人參皂苷Rg2作為人參中的主要有效成分，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面擁有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景[5]。 CCI 模型是最經(jīng)典的、最常用的疼痛模型，造模方法簡(jiǎn)便、反映穩(wěn)定，其疼痛特征和神經(jīng)病理性疼痛十分相似，可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸發(fā)痛等痛覺過敏[9]。本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠CCI模型，手術(shù)后1～14 d時(shí)，機(jī)械性疼痛閾值和光照輻射熱疼痛潛伏期與假手術(shù)組比較均明顯縮短。

在臨床上慢性疼痛患者常常伴隨焦慮、抑郁等情緒。抑郁狀態(tài)可以縮短機(jī)體對(duì)疼痛反應(yīng)的閾值，慢性疼痛可以誘發(fā)抑郁行為。通過慢性應(yīng)激的方法建立的抑郁模型大鼠對(duì)甲醛誘導(dǎo)的自發(fā)性疼痛更加敏感，同時(shí)抗抑郁藥物能夠改善其痛覺過敏。慢性刺激誘導(dǎo)的抑郁狀態(tài)能夠加劇大鼠對(duì)疼痛反應(yīng)的敏感性[10]。葉永賢等研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)結(jié)扎的大鼠表現(xiàn)為持續(xù)熱痛閾縮短，明箱內(nèi)停留時(shí)間縮短、穿梭次數(shù)減少，強(qiáng)迫游泳潛伏期延長(zhǎng)[11]。但也有研究發(fā)現(xiàn)破壞調(diào)控痛情緒的高級(jí)中樞脊髓上中樞的前扣帶皮層可以改善疼痛情緒方面的反應(yīng)，而不能改變急性疼痛的痛覺行為[12]。本研究采用明暗箱測(cè)試和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)同時(shí)觀察了CCI模型的焦慮、抑郁等情緒變化情況，發(fā)現(xiàn)CCI手術(shù)后14 d大鼠同時(shí)具有焦慮、抑郁的表現(xiàn)。中藥治療抑郁癥，具有不良反應(yīng)少、可長(zhǎng)期服用、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。2017 年， Ren 等[13]首次證明了人參皂苷Rg2 與氟西汀類似對(duì)小鼠具有抗抑郁作用。其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)信號(hào)通路發(fā)揮作用。研究通過強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、尾部懸吊試驗(yàn)和蔗糖偏好試驗(yàn)三種行為學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，人參皂苷Rg2 確實(shí)具有抗抑郁效果。此外，Western印跡分析顯示，人參皂苷Rg2 可增加海馬中的BDNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

腹腔腸系膜面積大、血管和淋巴管分布豐富，吸收能力強(qiáng)。不同給藥途徑對(duì)各種疼痛的臨床治療效果不同，SD大鼠選擇腹腔注射給藥，藥物吸收快，容易達(dá)到藥物治療濃度，而且實(shí)驗(yàn)操作比較方便[14-15]。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射人參皂苷Rg2能夠延長(zhǎng)CCI模型大鼠機(jī)械性縮足反射閾值和熱縮足潛伏期，同時(shí)也能緩解CCI大鼠的焦慮、抑郁狀態(tài)。

疼痛常伴隨抑郁狀態(tài)，疼痛治療的同時(shí)要關(guān)注抑郁指標(biāo)的變化，關(guān)鍵時(shí)刻可以考慮選擇性的使用抑郁藥物進(jìn)行綜合治療。綜合的心理及藥物干預(yù)將有助于闡明痛覺的調(diào)控機(jī)制，從而指導(dǎo)疼痛的臨床治療。