章書豪， 邵思銘， 陳方政， 祝 靜， 陳羅薇, 王 恒, 項歆惠， 袁琳波

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院， 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院， 4. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 浙江 溫州 325000 )

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類以肺動脈壓力進行性升高為特點的致命性肺血管疾病，嚴重的限制了患者的運動耐受性，且可能會發(fā)展為心力衰竭、慢性阻塞性肺病等多種心肺疾病[1-2]。肺動脈高壓的形成主要和肺血管收縮和重構(gòu)有關(guān)，但是具體發(fā)生機制目前仍不清楚[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺動脈高壓中細胞受到炎癥刺激，COX-2的含量上升,引起炎癥部位PEG2、PGI2和PGE1含量增加，導(dǎo)致肺動脈血管炎癥反應(yīng)和組織損傷[4]。在肺動脈高壓中使用COX-2抑制劑和下調(diào)前列腺素，能夠調(diào)控血管內(nèi)細胞活性[5]，因此COX-2可以作為多種抗炎癥藥物靶點。

蘋果多酚(apple polyphenol，APP)是從蘋果中提取的次生植物代謝產(chǎn)物，能通過ros/MAPK/NF-κB通路在抗氧化和抗炎癥中發(fā)揮重要作用[6]。在心血管疾病研究中發(fā)現(xiàn),蘋果多酚能夠起到緩解動脈粥樣硬化[7]，激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，從而改善內(nèi)皮細胞效應(yīng)，降低肺部血壓[8]。但是目前鮮有研究其在肺動脈高壓的作用。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)蘋果多酚有助于緩解炎癥反應(yīng)、血管收縮和平滑肌細胞的增殖作用，從而能夠改善肺動脈高壓。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

蘋果多酚購自上海源葉生物科技有限公司，野百合堿(MCT)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。COX-2抗體購自英國Abcam公司, eNOS抗體和Abcam購自Cell Signaling Technology(Danvers, MA,USA)，PowerLab 4/35(澳大利亞AD Instruments)，生理壓力傳感器(BL—Newcentmry,成都泰盟科技有限公司)，CO檢測器(ml313C, AD儀器)，NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗動物分組與處理

實驗采用雄性SD大鼠，體重(180～200 g)，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(20140038)。購入后普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)間溫度22～25℃, 相對濕度50%～60%。本實驗嚴格遵循美國國立衛(wèi)生研究院所制定的《實驗動物使用指南》，實驗方案經(jīng)過溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理學(xué)會審批。大鼠采用隨機編號分為四組(Con組，MCT組，APP組，MCT+APP組)，每組9只(1)Con組：大鼠皮下注射生理鹽水，作為對照組。(2)APP組：隔天按20 mg/kg的劑量腹腔注射蘋果多酚。(3)MCT組：按60 mg/kg劑量皮下注射MCT。(4)MCT+APP組：皮下注射60 mg/kg劑量MCT,隔天按20 mg/kg劑量腹腔注射APP，所有處理持續(xù)3周[9]。

1.3 大鼠體重與3周存活率的測定

各組大鼠于處理前和處理后一周、兩周、三周時分別進行稱重，并統(tǒng)計3周后各組存活大鼠數(shù)量，計算存活率。

1.4 肺動脈動力學(xué)測量

處理三周后，大鼠用3 ml/1 kg的水合氯醛麻醉，暴露右頸外靜脈，行頸外靜脈插管術(shù)，連接血壓壓力換能器至powerlab生物信號采集分析系統(tǒng)，對肺動脈壓力(mean pulmonary artery pressure，mPAP)進行讀值。用熱稀釋法檢測心輸出量(cardiac output, CO)，用CO檢測器(ml313C, AD儀器)處理數(shù)據(jù)。PVR用公式計算:PVR=mPAP/CO

1.5 右心室肥厚指數(shù)測量

大鼠處死解剖，將心臟沿著心室邊緣和室間隔將右心室切開。用生理鹽水略洗，除去多余心肌組織，用濾紙吸干其表面水分，稱量右心室、左心室、室間隔(left ventricle+ Interventricular septum, LV+S)的重量，右心室肥大指數(shù)計算公式:RV /(LV + S)×100%。

1.6 肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)的組織病理學(xué)觀察

將大鼠肺組織脫水透明，浸蠟包埋，65℃烘箱中烘干，二甲苯中脫蠟兩次，在濃度分別為100%、95% 、90%、80%、70%的酒精中依次浸泡3 min，再經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入蘇木精染色。通過1%鹽酸乙醇進行分化。再將切片用伊紅染色并用蒸餾水洗滌后用70%，85%，95%，100%濃度梯度的乙醇脫水。二甲苯透明化后用中性膠固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)，以評估組織病理學(xué)變化。

1.7 肺動脈血管環(huán)外周長比值(WT%)，肺小血管管壁面積和管總面積比值(WA%)測量

采用病理圖像分析軟件 Image-pro Plus，測量肺動脈外徑(the diameter of external vessal, ED)，內(nèi)徑(the diameter of internal vessal, ID)和內(nèi)側(cè)壁厚度(medial wall thickness, MWT)。 肺動脈介質(zhì)厚度(pulmonary arterial media thickness, PAMT)可以通過以下公式計算：PAMT = 2×MWT / ED，計算壁面積(WA)，總面積(total area, TA)，血管內(nèi)腔面積(lumen area, LA)。計算WT%公式：WT%= 2×PAMT / ED×100%，計算WA%公式：WA%=(TA-LA)/ TA×100%。

1.8 通過Q-PCR檢測基因表達

將各組肺組織樣品剪成小塊后碾磨，加入TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離出全部RNA。使用GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)將RNA用作模板以產(chǎn)生cDNA合成。用于RT-PCR的引物序列如表1：

Tab. 1 The primer sequences used for RT-PCR

對于每個樣品，三次進行RT-PCR實驗。通過瓊脂糖凝膠電泳確認PCR產(chǎn)量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡檢測COX-2和eNOS水平

通過10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，切除肺組織。分離肺主動脈，剪開動脈，內(nèi)膜面貼于培養(yǎng)皿置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱0.5 h后加含15%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第5日內(nèi)皮細胞爬出后摘掉除組織塊，取內(nèi)皮細胞放入EP管中，研磨后加入200 μl細胞裂解液，再次研磨置于離心機中14 000g離心15 min，收集上清液。酶標儀檢測蛋白質(zhì)濃度，加上樣緩沖液煮沸保存。制備SDS-PAGE凝膠。通過10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在通過多克隆抗COX-2(或抗eNOS)檢測COX-2(或eNOS)后，使用ECL成像系統(tǒng)顯示條紋灰度級來測量COX-2(或eNOS)的含量。

1.10 內(nèi)皮細胞中NO水平檢測

內(nèi)皮細胞分離方法同上，使用NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)來定量測定內(nèi)皮細胞內(nèi)NO水平，所有測量均遵循制造商方案進行。

1.11 大鼠肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)與鑒定

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，分離肺組織中的肺動脈，在顯微鏡下剝離肺動脈內(nèi)外膜，將肺動脈中膜剪為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每4～6 d更換培養(yǎng)液1次(含15%胎牛血清的DMEM/F12)。16 d后細胞爬出，呈典型峰谷狀分布。經(jīng)抗α-actin單克隆抗體免疫組化鑒定，為純度97%以上的肺動脈平滑肌細胞。經(jīng)胰酶消化傳代培養(yǎng)，采用生長良好的4～7代細胞進行實驗。

1.12 平滑肌細胞內(nèi)Ca2 +水平檢測

通過Becton Dickinson FACS Calibur流式細胞儀，用Ca2++(-)敏感性熒光染料Fluo-3 /乙酰氧基甲酯(Fluo-3 / AM)測定平滑肌細胞內(nèi)Ca2+水平。使用PerkinElmer LS 55熒光分光光度計測定熒光值，每1分鐘激發(fā)和發(fā)射波長為488 nm和526 nm。使用以下等式，用fluo-3熒光強度計算平滑肌細胞內(nèi)Ca2+：[Ca2+] i = Kd [(F-Fmin)/(F max -F)]，其中Kd=400 nmol/L。通過添加0.1%Triton X-100測定最大Fluo-3熒光強度(Fmax)，通過加入5 mmol/L EGTA抑制Fluo-3熒光測定最小熒光強度(Fmin)。F是在不添加Triton-X-100或EGTA的情況下測量的熒光值。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的體重和存活率的影響

在建模和治療的3周中，Con組，APP組和APP + MCT組的平均體重增加，而MCT組的平均體重明顯減少。在治療結(jié)束時，MCT組的平均值低于Con組，APP組和APP + MCT組。 MCT + APP組的存活率高于MCT組，Con組和APP組的100%存活率。結(jié)果表明APP能夠提高大鼠存活率和體重(表2)。

2.2 APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺血流動力學(xué)的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的mPAP和PVR顯著增加(P<0.05)，這意味著成功建立PAH模型。 與MCT組相比，MCT + APP組的mPAP和PVR顯著降低(P<0.05)，顯示APP在治療MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠有顯著作用。APP組與Con組結(jié)果相同，說明APP無明顯副作用(表3)。

2.3 APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室重塑的影響

與Con組和APP組相比，MCT組的RVHI顯著升高(P<0.05)。與MCT組相比，MCT + APP組的RVHI顯著降低(P<0.05)，表明APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠右心室肥大有抑制作用(表3)。

Tab. 2 Effects of APP on body weight and survival rate of MCT-induced PAH rats (g, n=9)

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

GroupmPAPΔPVRRVHICon15.84±2.48213.37±30.290.17±0.03APP15.09±1.49212.93±27.980.16±0.03MCT56.49±7.71**698.68±80.69**0.50±0.09**APP+MCT39.53±8.85##498.59±115.32##0.35±0.10#

*P<0.05,**P<0.01vsCon group；#P<0.05,##P<0.01vsMCT group

2.4 APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動脈重構(gòu)的影響

組織鏡檢結(jié)果顯示Con組和APP組肺動脈壁平滑且內(nèi)皮細胞連續(xù)，平滑肌細胞無異常增厚現(xiàn)象，大多數(shù)肺泡壁完整。MCT組內(nèi)皮細胞不連續(xù)，且有炎性細胞浸潤，肺動脈中層有10～15層的平滑肌，血管出現(xiàn)明顯增厚和重構(gòu)現(xiàn)象。在MCT + APP組中，內(nèi)皮細胞連續(xù)完整，動脈中層8～12層平滑肌APP治療緩解了MCT對肺組織的結(jié)構(gòu)破壞，抑制了平滑肌細胞增厚(圖1A)。 MCT組的WT% (40.87%±7.58%)和WA%(82.00%±11.80%)顯著高于Con組的WT%(13.93%±3.00%)和WA%(59.00%±10.90%，P<0.05，圖1B和C)，MCT + APP組的WT%(25.36%±4.51%)和WA% (66.00%±10.90%)顯著低于MCT組(P<0.05，圖1B和C))，結(jié)果表明APP能夠緩解MCT誘導(dǎo)的血管重構(gòu)。

2.5 APP對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織COX-2 和炎癥因子表達的影響

MCT組中MPO ,IL-1 ,IL-6 ,TNF-α表達顯著高于Con組和APP組中的炎性因子表達(P<0.05，圖2A，B和C)。 APP可緩解MCT引起的肺組織炎癥，因為MCT + APP組MPO ,IL-1,IL-6 ,TNF-α表達明顯低于MCT組(P<0.05，圖2A，B和 C)。MCT組的COX-2表達(3.483±0.671)顯著高于Con組中的表達，而MCT + APP組的COX-2表達(1.815± 0.215)顯著低于MCT組(P<0.05，圖2E)，結(jié)果表明APP能夠抑制炎癥反應(yīng)。

Fig.1The effects of APP on the morphological and structural changes of pulmonary arterioles in the rats

A: Results of HE staining in rat lung tissue(× 200) ; B: Percentage of wall thickness to vascular diameter (WT%); C: Percentage of wall area to total vascular area (WA%).n=9

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

Fig.2The effects of APP on the expressions of MPO, IL-1, IL-6, TNF-α and COX-2 in the lung tissues(n=9)

A,B,C,D: Qrt-PCR results of MPO, IL-1, IL-6 and TNFα expressions in rats; E: Western blot results of COX-2 expression

*P<0.05,**P<0.01vsMCT group

2.6 APP對肺內(nèi)皮細胞內(nèi)eNOS表達及NO合成和肺動脈平滑肌細胞內(nèi)Ca2 +濃度的影響

MCT組的肺內(nèi)皮細胞NO合成水平(26.887±9.897)μmol/ L顯著低于Con組和APP組(55.777±9.823)μmol/ L(P<0.05，圖3A)。與MCT組相比，MCT + APP組肺內(nèi)皮NO合成水平(42.161± 3.948)μmol/ L明顯升高(P<0.05，圖3A)。同時，四組eNOS表達量顯示出同樣的結(jié)果。MCT組的eNOS表達(0.234±0.0705)顯著低于Con組(P< 0.05，圖3B)，MCT + APP組(0.545±0.154)顯著高于MCT組(P<0.05，圖3B)。MCT刺激和APP治療也引起了四組細胞內(nèi)Ca2 +濃度差異。MCT組的平滑肌細胞內(nèi)Ca2 +濃度顯著高于Con組和APP組(P<0.05，圖3C和D)。與MCT組相比，MCT + APP組顯著降低(P<0.05，圖3C和D)。這些結(jié)果表明APP可以緩解MCT造成的內(nèi)皮細胞eNOS表達下調(diào)的效應(yīng)，同時可以降低肺動脈平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。

Fig.3The effects of APP on the protein expression of eNOS and concentration of NO in endothelial cells and Ca2 +in pulmonary artery smooth muscle cells(n=9)

A: NO synthesis ofendothelial cells; B: eNOS expression of endothelial cells; C: The curves of intracellular Ca2+concentration varying along with time; D: Intracellular Ca2+concentration levels differed in pulmonary arterial smooth muscle cells

*P<0.05,**P<0.01vsCon group

3 討論

肺血管的收縮和重構(gòu)是各種病理類型肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的共同環(huán)節(jié)[10]。目前研究認為炎癥反應(yīng)會引起肺血管收縮和重構(gòu)的產(chǎn)生。一方面炎癥因子的過度表達會改變平滑肌細胞內(nèi)代謝通路關(guān)鍵酶的含量，誘導(dǎo)平滑肌細胞過度增殖，血管腔狹窄，導(dǎo)致肺血管阻力升高[11]。另一方面炎癥因子的釋放，白細胞的聚集誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷和凋亡，上調(diào)平滑肌細胞內(nèi)Ca2 +[12]。胞漿內(nèi)游離的Ca2 +[(Ca2 +)i]是肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)收縮，分化和增殖的關(guān)鍵作用因子，Ca2 +上調(diào)會導(dǎo)致血管重構(gòu)的發(fā)生[13]，兩者相互作用導(dǎo)致肺動脈高壓的形成。同時，COX-2作為COX家族的同工酶，其在正常細胞中的含量極低。但在炎癥因子的刺激下，COX-2會過度表達并上調(diào)炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵酶含量和活性。因此COX-2是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵指標[14]。COX-2也被認為是抗炎藥物的治療靶點[15]。

蘋果多酚是一種提取自蘋果的多酚類物質(zhì)，以往研究發(fā)現(xiàn)其具有很強的抗炎活性[15]。在我們的實驗中，發(fā)現(xiàn)蘋果多酚不僅可以通過抑制炎癥因子COX-2和IL-1，IL-6，TNF-α，MPO 的表達，減輕炎癥反應(yīng)和血管壁內(nèi)白細胞聚集。還可以通過促進內(nèi)皮細胞合成eNOS，釋放NO，起到緩解血管收縮和保護內(nèi)皮細胞的作用。保持血管壁內(nèi)皮細胞的完整，能夠通過內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，胞間信號傳導(dǎo)降低平滑肌細胞內(nèi)Ca2 +含量，抑制平滑肌細胞增殖，從而逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，改善血液動力學(xué)指標。此外，還有實驗發(fā)現(xiàn)，蘋果多酚能夠通過NF-κB通路減輕內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)[16]，介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路促進細胞凋亡，于在心血管疾病中，蘋果多酚還能夠通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)MAPK的激活預(yù)防早期動脈粥樣硬化[17]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)蘋果多酚主要通過調(diào)節(jié)炎癥因子表達和細胞內(nèi)NO和Ca2 +，保護內(nèi)皮細胞，抑制平滑肌細胞增殖，來逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)過程，并且沒有副作用。目前還有研究指出蘋果多酚能夠通過代謝途徑和其他炎癥通路，抑制肺平滑肌細胞增殖，但具體機制尚不清楚，仍有待研究。但其是天然植物提取物，易提取純化，且無明顯毒副作用，具有良好的廣泛應(yīng)用前景。