袁 輝， 揚(yáng)國宏， 李 姝， 李 麗， 宋高臣， 徐長慶， 孫 健△

( 1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011； 2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室， 黑龍江 哈爾濱 150081)

鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR) C家族成員。近年來研究證實(shí), CaSR 在心血管系統(tǒng)有功能性表達(dá), 并且參與一些重要病理過程的發(fā)生發(fā)展, 例如:心肌缺血/再灌注損傷[1]和心肌肥大等[2]。本課題組曾先后觀察了不同鼠齡正常大鼠、離體灌流和冠脈結(jié)扎復(fù)制的大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型中的心肌 CaSR 的表達(dá)規(guī)律[1,3,4]，然而CaSR在大鼠心肌梗死不同時期的表達(dá)規(guī)律，及其對心肌細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后不同時間內(nèi)CaSR的表達(dá)情況，并揭示其對心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

超聲系統(tǒng)(IE33，荷蘭)，H - 600 型透射電鏡 (日立)，熒光定量PCR儀(Exicycler 96，韓國)，紫外分光光度計(jì)(NANO 2000，America)，BL420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟)，肌酸激酶(CK)和LDH測定試劑盒(南京建成)，高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke)，大鼠心肌肌鈣蛋白cTnT ELISA試劑盒(USCN)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(Germany)，Bax、Bcl-2多克隆抗體 (Santa Cruz, CA, USA)，CaSR、caspase-3、caspase-9單克隆抗體(Abcam，英國)。

1.2 急性心肌梗死模型制備

選取健康Wistar大鼠(8周齡)，隨機(jī)分為對照即假手術(shù)組(Sham組，冠脈只穿線不結(jié)扎)和AMI模型1周、2周和4周組(每組成功存活n=5)，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉，AMI組大鼠左前胸去毛消毒，開胸暴露心臟，剪開心包，在左心耳下緣與肺動脈間可見左冠狀動脈前降支起始部，在距離主動脈根部約3～5 mm處，以左冠狀靜脈為標(biāo)志，用尼龍縫線結(jié)扎造成缺血，建立AMI模型。

1.3 心血流動力學(xué)檢測

分別于實(shí)驗(yàn)后第1、2、4 周采用10%水合氯醛實(shí)施麻醉，然后將Millar導(dǎo)管沿頸動脈插入至左心室, 測定左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)，左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure, LVSP)，左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速率(-dp/dtmax)等血流動力學(xué)指標(biāo)。

1.4 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)

大鼠經(jīng)耳緣靜脈推注10%KCl處死。取各組大鼠心尖區(qū)心肌組織，切成約1 mm3的組織塊，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，丙酮逐級脫水，石蠟包埋，超薄切片，1%醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，H-600A型透射電鏡觀察。

1.5 Real-Time PCR檢測CaSR mRNA表達(dá)

取梗死區(qū)心肌組織低溫充分研磨后，利用TRIzoI提取試劑盒提取各樣本總RNA后，進(jìn)行RNA濃度和純度檢測，接著逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。大鼠引物序列(表1)。

Tab. 1 Sequences for primers

Real-Time PCR反應(yīng)體系20 μl(cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR GREEN mastermix 10 μl，ddH2O 8 μl)。采用相對定量 2- △△ CT法分析數(shù)據(jù)。

1.6 Western blot檢測心肌組織中CaSR、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9 蛋白表達(dá)

提取梗死區(qū)心肌組織蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。SDS- PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育Ⅰ抗anti-CaSR(1∶500)，anti-Bcl-2(1∶ 1 000)、anti-Bax(1∶1 000)、anti-caspase-3(1∶ 1 000)和anti-caspase-9(1∶500)，4℃過夜。洗膜后加入羊抗兔IgG-HRP II 抗(1∶5 000)，ECL發(fā)光法測定目的條帶，凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.7 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labelling)染色方法檢測心肌細(xì)胞凋亡。按試劑盒說明書操作，切片常規(guī)脫蠟脫水，過氧化氫封閉，內(nèi)源性過氧化物酶標(biāo)記，信號轉(zhuǎn)化和分析。光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色或黑色；正常的細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染成藍(lán)色，每張切片隨機(jī)取 5個高倍視野, 計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù), 計(jì)算凋亡率。凋亡率=(凋亡細(xì)胞/全部細(xì)胞)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AMI 模型組的心電圖的變化

結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，左室前壁心肌組織搏動減弱，顏色蒼白，此時心電圖可見R波振幅升高，ST 段弓背向上抬高(圖1)，表明AMI 模型建立成功[5]。

Fig.1Changes of surface electrocardiogram in rats before and after left anterior descending coronary artery ligation

A: The Sham group; b: The AMI group

2.2 AMI 模型組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化

大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化如圖2 所示。電鏡下可見，AMI組細(xì)胞核和線粒體都發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)線粒體腫脹，心肌肌節(jié)斷裂、排列紊亂，肌原纖維溶解；上述結(jié)果說明心肌梗死后大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，電鏡下可見凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核裂解為碎塊。

Fig.2Ultrastructural changes of myocardial tissue under electron microscope (×15 000)

2.3 AMI 模型組大鼠心血流動力學(xué)變化

和Sham 組相比，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均有減少，LVEDP升高(P<0.05或0.01，表2)；但不同時間內(nèi)基本沒有變化。

GroupLVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(×103mmHg/s)-dp/dtmax(×103mmHg/s)Sham118.2±12.05.8±1.05.1±0.64.1±0.6AMI(1W)87.4±7.5*13.2±1.4**3.0±0.8*2.1±0.3*AMI(2W)86.2±8.7*13.3±1.8**3.3±0.5*2.3±0.4*AMI(4W)87.4±7.5*13.2±1.4**3.0±0.8*2.1±0.3*

LVSP： Left venteicular systolic pressure； LVEDP： Left ventricular end diastolic pressure； +dp/dtmax： Maximum increase rate of left chamber pressure； -dp/dtmax： Maximum falling rate of left chamber pressure

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.4 AMI 模型組大鼠血清CK和LDH活力及cTnT水平的變化

和Sham組相比，AMI組cTnT 水平、CK和LDH活性均升高 (P<0.05或0.01，表3)，隨著心肌梗死的發(fā)展，cTnT 水平和CK活性逐漸降低，LDH變化不明顯。

GroupcTnT(pg/ml)CK(U/ml)LDH(U/ml)Sham113.1±5.42.4±0.91.3±0.0AMI(1W)434.5±41.8**5.7±1.1**2.3±0.2**AMI(2W)319.4±7.6**##5.5±1.5**1.9±0.1**##AMI(4W)239.8±8.0**##△△4.9±0.7**2.0±0.2**#

CTnT： Troponin T； CK： Creatine kinase； LDH： Lactic dehydrogenase

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsAMI-1W;△△P<0.01vsAMI-2W

2.5 AMI 模型組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的變化

TUNEL檢測結(jié)果顯示(圖3)，造模后1、2、4周Sham組心肌細(xì)胞凋亡很少(3.55%±1.20%)、 (5.17%±1.94%)、(4.62%±1.73%)；心梗后不同時間心肌細(xì)胞凋亡明顯增加分別為：(26.48%± 5.22%)、(34.82%±6.88%)、 (41.59%± 7.43%)，差異有顯著性(P<0.01)。

Fig.3Results of TUNEL staining in rat cardiomyocytes and statistical analysis of apoptosis indexes (×400)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsAMI-1W

2.6 AMI 模型組大鼠心肌組織CaSR mRNA和CaSR蛋白表達(dá)的變化

如圖4示：與Sham組相比, 隨著時間延長，AMI組大鼠心肌組織CaSR mRNA和CaSR 蛋白表達(dá)均明顯增加，第1、2、4周相比差異顯著(P< 0.05)。

2.7 AMI 模型組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達(dá)的變化

Western blot檢測術(shù)后不同時間大鼠各組心肌組織Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(dá)(圖5)：術(shù)后第1、2和4周時和Sham組相比，AMI組Bcl-2蛋白表達(dá)均減少(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)隨著時間的延長逐漸增多，caspase-9在第4周時有所下降，但和第1、2周相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Fig.4The changes of CaSR protein and mRNA by Western blot and quantitative real-time PCR after AMI from 1 week to 4 weeks

A: The changes of CaSR mRNA by quantitative real-time PCR; B: The changes of CaSR protein by Western blot; C: Quantitative analysis of the Western blot result

**P<0.01vssham group；##P<0.01vsAMI-1W；△△P<0.01vsAMI- 2W

Fig.5The expressions of Bcl- 2, Bax, cleved caspase-3 and cleved caspase-9 protein in rat cardiac tissue from different time

Bcl- 2: B Cell Leukemia 2； Bax: Bcl-2 associated X protein

*P<0.01vssham group;##P<0.01vsAMI-1W;△P< 0.05vsAMI-1W

3 討論

鈣敏感受體(CaSR)是調(diào)節(jié)鈣代謝的重要因素，還參與細(xì)胞增殖、分化等的調(diào)節(jié)。自2003年Wang等[3]首次證實(shí)在大鼠心肌組織存在CaSR表達(dá)后，本課題組曾先后證實(shí)CaSR參與了一些重要病理過程的發(fā)生發(fā)展，如2015年白淑芝等[6]研究發(fā)現(xiàn)大鼠糖尿病性心肌病進(jìn)展過程中 CaSR 的表達(dá)逐漸降低，并可能導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)紊亂參與糖尿病心肌病的發(fā)生；2012年Guo J等[7]研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化大鼠心肌 CaSR 的表達(dá)增加導(dǎo)致對心肌梗死的敏感性增加。但 CaSR 在心肌梗死后不同時期的表達(dá)變化規(guī)律還不清楚。本研究旨在觀察CaSR在心肌梗死后不同時期的表達(dá)變化規(guī)律，及其對心肌細(xì)胞凋亡的影響。

臨床實(shí)踐表明，心肌損傷過程中，常伴有心電圖和血清酶譜的變化，其中 ST 段抬高是心肌缺血的典型表現(xiàn)；而血清心肌酶水平是心肌細(xì)胞受損程度的重要標(biāo)志，包括血清 LDH、CK、CK-MB 等；其中尤以肌鈣蛋白特別是 cTnT 表達(dá)水平敏感性和特異性最高，是目前理想的心肌梗死標(biāo)志物[8]。

本研究顯示，AMI組心電圖呈缺血樣改變，S-T 段明顯上抬，此時大鼠左室前壁心肌組織搏動減弱，顏色蒼白，出現(xiàn)心肌梗死變化。且模型成功后不同時間均伴有血清酶譜 LDH、CK 和肌鈣蛋白c TnT 表達(dá)水平的升高，心功能各指標(biāo)LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax的減少和LVEDP的增加。這些均表明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了大鼠心肌梗死模型。

為了觀察心肌梗死后 CaSR 在不同時間內(nèi)的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)中分別采用RT-PCR和Western blot技術(shù), 觀察了CaSR mRNA和蛋白在AMI模型成功后第1、2、4周的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著心肌梗死的發(fā)展，大鼠心肌組織中CaSR mRNA和蛋白表達(dá)均逐漸增多，提示心肌 CaSR的表達(dá)增加參與了心肌梗死的發(fā)生發(fā)展。

電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法，本實(shí)驗(yàn)電鏡觀察結(jié)果顯示，AMI組大鼠心肌細(xì)胞中細(xì)胞核和線粒體都發(fā)生了嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為心肌肌節(jié)纖維排列紊亂，肌絲溶解、斷裂；線粒體腫脹；染色質(zhì)濃縮、沿核膜呈周邊性排列，形成大小和形狀不一的碎片及塊狀；本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用TUNEL法檢測了不同時間各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡指數(shù)。結(jié)果顯示，與Sham 組相比，隨著時間的延長，AMI組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高，上述結(jié)果說明心肌梗死后心肌損傷可以引起大鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)生凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變。

研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡是心肌缺血損傷中心肌細(xì)胞死亡的重要方式之一[9]。Caspase 家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其成員 Caspase-3 是整個凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志酶。Caspase-3 通過對蛋白激酶、核酸酶及細(xì)胞骨架的裂解，直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡，被認(rèn)為是執(zhí)行死亡蛋白酶[10]；細(xì)胞凋亡有兩條經(jīng)典途徑，其一是細(xì)胞外的死亡受體途徑，其中涉及多種凋亡調(diào)控基因如促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2等，最終作用于Caspase3，使其活化后促發(fā)下游基因的活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11,12]。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，各時間點(diǎn)AMI組抑制凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)減少，而與促進(jìn)凋亡的相關(guān)蛋白表達(dá)Bax，caspase-3和caspase-9則增多；且有明顯時間差異。有研究證實(shí)[7]活化CaSR 的信號，通過一系列的G 蛋白，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣和MAPK信號途徑進(jìn)而激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示在心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中，心肌組織中CaSR表達(dá)逐漸增多，但是是否也通過MAPK信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bax，caspase-3的表達(dá)，從而調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，我們將在進(jìn)一步研究中探討。

總之，我們的結(jié)果表明隨著大鼠急性心肌梗死時間的延長，心肌組織中CaSR表達(dá)逐漸增多，通過某些信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，參與心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過程。但其具體機(jī)制還需我們在今后的研究中進(jìn)一步探討。